Mise en evidence, purification et caracterisation des proprietes d'une pullulanase thermostable issue d'une archaebacterie thermophile extreme de l'ordre des thermococcales isolee des ecosystemes hydrothermaux oceaniques abyssaux

par HUBERT GANTELET

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Francis Duchiron.

Soutenue en 1996

à Reims .

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  • Résumé

    L'activite pullulanase a ete recherchee chez des isolats thermophiles provenant de sources hydrothermales des fonds marins. Deux isolats (al662 et st489) produisent cette activite enzymatique avec les meilleurs rendements en presence de maltose dans le milieu de culture: 5 u/l en flacons. Ces deux isolats sont des archaebacteries, ils appartiennent a l'ordre des thermococcales et au genre thermococcus. Ils ont ete isoles au niveau de sites hydrothermaux du pacifique oriental et du bassin nord-fidjien. Les activites sont principalement extracellulaires et caracterisees dans l'extrait brut par une temperature optimale de 95c (isolat al662) et 80-95 c (isolat st489), des ph optimaux situes vers 5,0-7,0 et un haut degre de thermostabilite. L'isolat al662 (une espece nouvelle du genre thermococcus) a ete retenu pour la suite de l'etude, et la production maximale de pullulanase a ete obtenue avec le milieu bhi-s plus 4 g/l de maltose. Des cultures en fermenteur, en utilisant le milieu cite precedemment, ont permis d'etudier la production de l'enzyme au cours de la croissance et d'obtenir une activite de 35 u/l. La pullulanase purifiee 97 fois a partir du surnageant de culture est homogene. L'enzyme purifiee est composee d'une seule chaine polypeptidique: sa masse molaire est estimee a 110 kda par gel-filtration et a 128 kda par sds-page. L'enzyme est optimalement active a ph 5,5 et a 95 c. Le calcium augmente considerablement la thermostabilite et la thermoactivite de l'enzyme purifiee. Celle-ci est capable d'hydrolyser les liaisons glucosidiques alpha-1,6 du pullulane mais egalement les liaisons glucosidiques alpha-1,4 de l'amylose ; elle peut ainsi etre classee parmi les pullulanases de type ii ou amylopullulanases. Une preparation brute de pullulanase de l'isolat al662 a ete utilisee pour des essais de production de sirops de glucose et de maltose. L'emploi de pullulanase lors de la production de sirop de glucose permet de diminuer nettement la duree de la reaction de saccharification. Dans le cas de la production de sirop de maltose, la pullulanase ajoutee a la beta-amylase conduit a une hydrolyse pratiquement complete du substrat, ce qui se traduit par une augmentation du rendement en sucres totaux


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  • Détails : 169 P.
  • Annexes : 147 REF.

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  • Bibliothèque : Université de Reims Champagne-Ardenne. Bibliothèque universitaire. Bibliothèque Moulin de la Housse.
  • Disponible pour le PEB
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