La phospholipase b digestive du cobaye. Implication des n-glycosylations dans les proprietes physiologiques de la proteine. Clonage de l'adn#c, etude de l'expression tissulaire et lors de la differenciation intestinale

par CLAIRE DELAGEBEAUDEUF

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de H. CHAP.

Soutenue en 1996

à Paris 11 .


  • Résumé

    La phospholipase b intestinale du cobaye est une enzyme digestive qui possede les trois activites: phospholipase a#2, lysophospholipase et diacylglycerol lipase. Nous avons mis en evidence que la phospholipase b du cobaye est une proteine de 140 kda dont 23% du poids moleculaire apparent est constitue de n-glycosylations du type complexe. En revanche, elle ne porte pas de liaisons o-glycosidiques. Le meme patron de n-glycosylation est observe pour l'enzyme exprimee dans les cellules immatures, situees dans les cryptes intestinales et dans les cellules matures bordant la villosite. D'autre part, l'elimination par coupure enzymatique de ces n-glycosylations provoque une diminution de 27-35% des activites phospholipase a#2, lysophospholipase et diacyl-glycerol lipase de l'enzyme. Cette diminution est le reflet d'une baisse de vitesse maximale enzymatique (vm) sans modification de l'affinite apparente de l'enzyme pour le substrat (km). De plus, l'enzyme deglycosylee n'est pas plus sensible a la chaleur que la forme native. Nous avons realise le clonage de l'adnc de la phospholipase b du cobaye, a partir d'un microsequencage de la proteine. L'adnc obtenu (4615 paires de bases (pb)) a ete sequence dans sa totalite, il contient un cadre ouvert de lecture de 4392 pb. La sequence peptidique qui en est deduite (1463 acides amines) fait apparaitre divers elements structuraux qui nous confirment qu'il s'agit d'une proteine transmembranaire: sequence signal amino-terminale et segment hydrophobe carboxy-terminal. Elle possede quatre domaines repetes en tandem dont le deuxieme et le quatrieme portent chacun une sequence signature des serines actives. Douze sites potentiels de n-glycosylation sont aussi localises sur cette sequence, qui presente, par ailleurs, une tres forte homologie avec l'esterase-phospholipase clonee de l'intestin de lapin adulte. L'expression de la phospholipase b (proteine et arnm) est tres strictement correlee avec la differenciation de la cellule intestinale puisqu'elle est tres faible dans les cellules souches intestinales alors qu'elle est maximale dans la cellule mature. Enfin, l'expression tissulaire de l'arnm codant pour la phospholipase b intestinale du cobaye revele que son gene est transcrit uniquement dans l'intestin et l'epididyme. Cette derniere localisation est interessante car l'epididyme est le siege d'une production importante et specifique de glycerophosphocholine, obtenue lors de l'hydrolyse de la phosphatidylcholine par une phospholipase b. La proteine recherchee dans ce dernier organe semble etre legerement differente de celle de l'intestin alors que l'arnm parait identique. Le role et la nature exacte de la phospholipase b epididymale restent a definir

  • Titre traduit

    Complete primary structure of guinea pig intestinal phospholipase b. Effects of n-oligosaccharide removal on its enzymatic activities and stability. Phospholipase b expression during enterocyte differentiation and in tissues


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Informations

  • Détails : 162 P.
  • Annexes : 252 REF.

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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2014-013035
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