Les nitriles hydratases a fer non heminiques : nature du site actif, mecanisme d'action et mise au point de systemes chimiques modeles

par MARIE-AUDE KOPF

Thèse de doctorat en Chimie organique et bio-organique

Sous la direction de Daniel Mansuy.

Soutenue en 1996

à Paris 6 .

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  • Résumé

    Les nitrile hydratases (nhases) sont les seules metalloproteines a fe(iii) non heminique spin faible. Elles permettent l'hydrolyse des nitriles en amides. De ce fait, elles presentent un interet tant sur le plan fondamental qu'industriel. Afin d'etudier ce systeme, deux approches concomitantes, l'une biochimique et l'autre biomimetique, ont ete realisees. Nous avons tout d'abord determine la nature des cofacteurs metallique et organique presents dans la nhase de brevibacterium r312. Ainsi, contrairement aux donnees de la litterature, nous avons montre que cette enzyme ne possedait pas de cofacteur pyrroloquinoleine quinone (pqq) libre ou lie. Concernant le cofacteur metallique, nous avons pu doser deux atomes de fer par tetramere #2#2. Puis, afin de mieux comprendre leur mecanisme d'action, nous avons etudie le mode d'interaction de ces nhases avec, d'une part, l'acide butyrique (connu pour son role protecteur durant la purification et le stockage de l'enzyme) et d'autre part, des nitriles, substrats ou inhibiteurs. Nous avons ainsi clairement mis en evidence i) l'effet inhibiteur (competitif) de l'acide butyrique vis-a-vis de la nhase de br312 et ii) l'existence d'un equilibre entre l'enzyme et la forme acide de l'acide butyrique. A partir de ces resultats, nous avons pu proposer une nouvelle structure du site actif permettant d'expliquer le role protecteur de cet acide. Des etudes de l'enzyme par differentes techniques spectroscopiques nous ont permis de mettre en evidence pour la premiere fois la coordination de l'azote du nitrile ou d'un de ces derives au fer de la nhase. Nous en avons deduit un mecanisme d'hydrolyse des nitriles en amides permettant d'unifier les nhases et les nitrilases par le role essentiel joue par une cysteine et de justifier leurs differences par le role specifique du fer. Enfin, l'approche biomimetique a consiste en la synthese et la caracterisation de complexes du fer, modeles de nhases. Un ligand bidentate (nsh) et un ligand tetradentate original (n#2s#2h#2) possedant tous un ou plusieurs motif(s) pyridinique(s) ont ete synthetises. La complexation par fecl#3 du ligand tetradentate a fourni le premier exemple de complexe du fer a l'etat d'oxydation fe(iii) possedant un spin intermediaire s = 3/2 et une sphere de coordination mixte azotee et soufree. Sa structure cristallographique a ete determinee. Enfin, un des complexes synthetises presente une activite interessante puisqu'il permet l'hydrolyse du p-nitrobenzonitrile (pour l'instant non catalytique) ainsi que la reduction des fonctions nitrees en amines en presence de mercaptoethanol.

  • Titre traduit

    Non heme iron nitrile hydratases : nature of the active site, mechanism and synthesis of chemical models


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Informations

  • Détails : 283 P.
  • Annexes : 181 REF.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
  • Accessible pour le PEB
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : PMC RT P6 1996
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