Utilisation de la spectrometrie de masse pour le controle de l'usage des steroides anabolisants en elevage. Application a l'etude du metabolisme de la 4-chlorotestosterone acetate chez le bovin

par Bruno Le Bizec

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de F. ANDRE.

Soutenue en 1996

à Nantes .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Cette etude s'inscrit dans le cadre du controle de l'usage illegal des xenobiotiques anabolisants comme promoteurs de croissance en productions animales. Elle presente une serie de travaux en spectrometrie de masse consacres a la recherche et a l'identification des residus de ces molecules. Les differentes techniques de couplage chromatographie-spectrometrie de masse ont ete evaluees en terme d'applicabilite a l'analyse de residus de steroides dans des matrices biologiques, a des concentrations avoisinant le pg-ml#-#1. Une methode d'analyse a finalite multi-residus a ete developpee, avec pour principaux objectifs la detection des steroides anabolisants dans l'urine et leur confirmation, conformement aux criteres prescrits par la decision europeenne 93/256. Les parametres optimaux de deconjugaison, enzymatique et chimique, des metabolites de phase ii ont ete etudies. Un temps minimal (15 h), une temperature (52c) ainsi qu'un ph optimal (5,2) de fonctionnement ont permis d'hydrolyser une quantite maximale de steroides sulfates grace au suc d'helix pomatia. Ce traitement enzymatique reste cependant inefficace sur certaines formes de steroides. Une etude approfondie des conditions de solvolyse et de methanolyse nous a permis de pallier cette insuffisance. Parallelement, les recherches conduites sur les methodes d'extraction et de purification des xenobiotiques anabolisants dans l'urine ont abouti a la combinaison d'une extraction sur phase solide (c18), d'une extraction liquide/liquide en milieu alcalin, et d'un fractionnement sur colonne de silice. Afin d'optimiser les conditions d'analyse en gc-ms, la recherche d'une methode de derivation a ete initiee. De nombreux derives ont ete compares en terme de sensibilite et de specificite dans plusieurs modes d'ionisation (ei, pci et nci). Les derives les plus adequats pour la methode de depistage ont ete synthetises avec le mstfa/tmis/dte. Faute d'obtenir suffisamment d'ions diagnostiques en gc-ms, un nouveau reactif de sily lation constitue d'un melange de mtbstfa/tbdmsc1/pyridine/acetonitrile/nh#4i, destine a apporter des informations structurales complementaires, a ete utilise. L'application successive des deux silylants sur un meme extrait a permis a la methode d'etre en conformite avec les criteres definis au niveau europeen. Parallelement, ont ete developpees des methodes d'extraction sur des matrices biologiques qui sont, soit des voies d'excretion majeures ou de stockage privilegie de certaines molecules (feces, graisses pour les gestagenes), soit des substrats d'analyse obliges (abats, muscles sur carcasses importees). Outre l'aspect purement de controle, cette approche methodologique a permis d'initier l'etude chez le bovin du metabolisme de la 4-chlorotestosterone acetate (cta). Ce steroide a activite androgenique est retrouve depuis peu dans beaucoup de traces d'injection prelevees en abattoir par les services veterinaires. La combinaison d'une hplc preparative et de la chromatographie gazeuse couplee a la spectrometrie de masse (analyseur quadripolaire et secteur electromagnetique), a permis d'elucider la structure des principaux metabolites de la cta. Dans l'ordre decroissant de leur concentration urinaire, ont ete identifiees la 4-chloro-4-androsten-3-ol-17-one (m3), la 4-chloro-4-androsten-3,17-dione (m4), la 4-chloro-4-androsten-3-one-17-ol (m2), la 4-chloro-4-androsten-3-one-6,17-diol (m8), la 4-chloroandrostan-3-ol-17-one (m5), la 4-chlorotestosterone (m1), la 4-chloroandrostan-3, 17-diol (m6) et la 4-chloro-4-androsten-3,17-diol (m7). Certaines structures ont ete confirmees par synthese organique. Ces metabolites ont ete pour la plupart identifies sous leur forme sulfate, excepte m3, majoritairement conjugue avec l'acide glucuronique. Les quatre metabolites les plus intenses ont pu etre detectes dans l'urine avec un gc-ms quadripolaire, jusqu'a un mois et demis apres l'injection intramusculaire de cta a un bovin adulte. Le fruit de ces recherches a ete applique dans les methodes de depistage vouees au controle de l'utilisation illegale des steroides en elevage ; de nombreux cas de positivite ont ainsi pu etre detectes et confirmes


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Informations

  • Détails : 346 P.
  • Annexes : 500 REF.

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  • Bibliothèque : Université de Nantes. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 96 NANT 2007
  • Bibliothèque : Université de Nantes. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 96 NANT 2007
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