Le facteur d'élongation eucaryotique EF-2 : effets de la phosphorylation, préparation et propriétés de fragments, utilisation du système d'expression hétérologue Pichia pastoris

par Agnès Dumont-Miscopein

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Jean-Paul Reboud.

Soutenue en 1996

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Jean-Paul Reboud.


  • Résumé

    Au cours de l'etape d'elongation de la synthese proteique, le facteur d'elongation eucaryotique ef-2 catalyse la translocation du peptidyl-arnt du site a au site p du ribosome en presence de gtp et le mouvement du ribosome le long de l'arnm. Ef-2 peut subir in vivo deux modifications post-traductionnelles qui l'inactivent totalement: l'adp-ribosylation et la phosphorylation. Actuellement, le mecanisme moleculaire par lequel la phosphorylation inactive le facteur n'est pas clairement defini. Ef-2 totalement phosphoryle a ete purifie, puis etudie dans le but d'eclaircir ce mecanisme. Ef-2 presente une fluorescence intrinseque caracteristique des residus tryptophane au nombre de sept dans cette molecule. Cette technique tres sensible de spectrofluorescence a permis de montrer que ef-2 phosphoryle a une affinite diminuee pour le gtp, mais pas pour le gdp. De plus, la capacite de ef-2 phosphoryle a former un complexe ternaire avec un analogue non hydrolysable du gtp et le ribosome, et sa capacite a proteger le ribosome de l'inactivation par la ricine sont diminuees dans les memes proportions. La diminution d'affinite de ef-2 phosphoryle pour le gtp pourrait expliquer l'interaction plus faible et/ou incorrecte avec le ribosome. Un domaine n-terminal de ef-2 renfermant le site de phosphorylation a ete prepare afin d'avoir un modele plus simple permettant l'etude de la phosphorylation. La digestion de ef-2 par l'endoproteinase glu-c dans des conditions menagees a permis d'isoler des domaines structuraux et fonctionnels. Le premier clivage conduit a la formation de deux fragments inegaux: un grand fragment n-terminal (f61) et un plus petit c-terminal (f34). L'obtention de ces fragments, et des alignements de sequence avec ef-g dont la structure tridimensionnelle a recemment ete determinee nous a permis de localiser ces domaines. Si ces fragments ne montrent aucune activite de synthese in vitro, qu'ils soient testes separement ou ensemble, f61 interagit avec le gtp et le gdp, mais ne peut pas etre phosphoryle. Il semble donc que la proteine entiere soit necessaire a cette phosphorylation. En revanche, f34 peut etre adp-ribosyle, mais ne semble pas capable d'interagir seul avec le ribosome. Cette etude des fragments de ef-2 represente une premiere approche des differents domaines qui peuvent etre predits dans cette molecule. Il apparait que la proteine entiere est necessaire pour etudier certaines proprietes, comme l'effet de la phosphorylation au niveau moleculaire. Nous avons donc entrepris de surproduire ef-2. Le systeme procaryotique n'ayant pas abouti a la production d'une proteine soluble, un systeme eucaryotique de levure, pichia pastoris a ete utilise. Nous nous sommes donc investis dans l'etude de ce systeme de production de proteines heterologues qui est relativement recent et en progression permanente


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Informations

  • Détails : 1 vol. (194 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 174-191

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