Caractérisation biochimique et génétique du gène UGP1 codant pour l'UDP-glucose pyrophosphorylase de Saccharomyces cerevisiae : ses implications dans le métabolisme intermédiaire et dans la synthèse des parois

par Jean-Marc Daran

Thèse de doctorat en Microbiologie. Biotechnologie

Sous la direction de Jean-Marie François.

Soutenue en 1996

à Toulouse, INSA .


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  • Résumé

    Le cadre ouvert de lecture ykl248, identifie sur le chromosome xi au cours du programme de sequencage systematique du genome de s. Cerivisiae (purnelle et al. , 1992) code pour l'udp-glucose pyrophosphorylsase (ugpase). Cette enzyme est responsable de la formation reversible d'udp-glucose-1-p et d'utp. Des preuves de la fonction de ce gene sont fournies par la comparaison de la sequence du produit du gene ykl248 avec des ugpases d'autres especes, par la complementation d'un mutant galu d'e. Coli deficient pour l'activite ugpase par ykl248 et par des etudes de surexpression du fragment ykl248. Par consequent, le gene sera renomme ugpl. La deletion-interruption du gene ugpi est letale pour la cellule, indiquant que la fonction du produit de ce gene l'ugpase, est essentielle pour la viabilite des cellules. Ce resultat n'est pas trop surprenant au vu de la position strategique de l'udp-glucose, produit de la reaction catalysee par l'ugpase. En effet, l'udp-glucose est le donneur de groupement glucosyl dans le formation des beta-glucanes de la paroi, du glycogene et du trehalose. Il est necessaire a la glycosylation des proteines et est requis pour l'assimilation du galactose et son entree dans la glycolyse. Pour caracteriser plus en detail la fonction du gene ugpi dans la cellule, nous avons genere des mutants conditionnels dans lesquels l'activite peut etre modulee a la hausse et a la baisse. Une souche haploide portant une copie chromosomique d'ugpi deletee est sauvee par un vecteur portant le gene ugpi dont l'expression est sous la dependance du promoteur hybride gal10 cyci, ainsi l'expression de ce gene est induite en presence de galactose et reprimee en presence de glucose. Les effets de la surexpression d'ugpi sur le metabolisme et la morphologie de la cellule sont dependants de la surce de carbone. Sur galactose, l'augmentation de 40 fois est accompagnee d'effets incluant une reduction du taux de croissance, une augmentation de 3 a 5 fois des metabolites, galactose-1-p-udp-galactose et udp-glucose, une plus grande sensibilite au cacofluor white et une augmentation des proteines glycosylees de la fraction microsomale. Par contre, aussi bien sur glucose qu'en culture sur maltose, la surproduction de 40 fois de l'activite ugpase ne s'accompagne que d'une augmentation de 2 fois la concentration en udp-glucose et de la teneur en glycogene. La reduction de l'activite ugpase ne s'accompagne que d'une augmentation de 2 fois de la concentration en udp-glucose et de la teneur en glycogene. La reduction de l'activite ugpase est effectuee en transferant les cellules en milieu glucose. De facon surprenante, la croissance de ces mutants est comparable a celle de la souche controle. L'activite ugpase chez ces mutants est reduite a 10% de celle mesuree dans la souche sauvage. Malgre cette absence d'effet sur la croissance, la reduction de 90% de l'activite s'accompagne de plusieurs evenements metaboliques et morphologiques. Ces mutants ont une division alteree caracterisee par lapresence simultanee de plusieurs bourgeons. Ils sont plus resistants a la digestion par la zymolyase (beta-1-3 glucanase), plus sensibles au calcofluor white et enfin ils montrent une diminution des beta-glucanes de la paroi. La deletion supplementaire des genes pgm1 et pgm2 dans un mutant ayant une activite ugpase modulable, accentue les modifications de la paroi et entraine une baisse supplementaire des beta-glucanes de la paroi. Toutes ces modifications engendrees par la manipulation du gene ugpi seront discutee par rapport a la place strategique occupee par l'udp-glucose dans le metabolisme de saccharomyces cerevisiae, et principalement par rapport a son role de precurseur pour la synthese des parois.

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  • Détails : [6] f.-184 p

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  • Cote : 1996/371/DAR
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