La seryl-arnt synthetase d'haloarcula marismortui : purification, stabilite, sequencage du gene, expression, modele structural et etude phylogenetique

par CLAIRE TAUPIN

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de REUBEN LEBERMAN.

Soutenue en 1996

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    La seryl-arnt synthetase d'une archaebacterie hyperhalophile, haloarcula marismortui (hmserrs), a ete purifiee. Elle est halophile et halostable, contrairement a l'enzyme homologue d'e. Coli. Les conditions optimales pour l'activite et la stabilite de la hmserrs sont pratiquement identiques dans le nacl et le kcl et caracteristiques des proteines hyperhalophiles ; en revanche, la hmserrs est denaturee a hautes concentrations en mgcl#2. Des spectres d'emission de fluorescence de la hmserrs ont mis en evidence un etat intermediaire de denaturation a basse salinite. Apres microsequencage peptidique de la hmserrs, des oligonucleotidiques ont ete concus pour amplifier par pcr un fragment du gene hmsers, fragment utilise pour cribler une banque partielle d'adn genomique d'h. Marismortui. C'est ainsi qu'a ete obtenu puis sequence le premier gene connu d'une aminoacyl-arnt synthetase d'archaebacterie hyperhalophile. L'adn du gene hmsers de type sauvage et celui d'un mutant de deletion d'une boucle specifique de la hmserrs ont ete clones dans des vecteurs d'expression specifiques d'e. Coli. Les essais d'expression ont produit une grande quantite de proteines recombinantes non solubles et non actives, qui ont ete solubilisees, mais qu'il n'a pas ete possible de rendre actives. L'analyse de la composition en acides amines de la hmserrs montre une tres grande richesse en acides amines acides, qui interviendraient dans la stabilisation de la proteine a hautes concentrations salines. L'analyse de la sequence de la hmserrs revele que cette proteine est beaucoup plus proche des serrss eubacteriennes que des serrss eucaryotes, et meme de l'autre serrs archaebacterienne. Le modele structural de la hmserrs permet de verifier que le grand exces de charges negatives est reparti a la surface de la molecule. L'etude phylogenetique des serrss conduit a des arbres phylogenetiques dans lesquels les archaebacteries apparaissent paraphyletiques, conclusion renforcee par l'enracinement de ces arbres, soit avec les thrrss, soit avec les asprss.


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  • Détails : 172 P.
  • Annexes : 184 REF.

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