Purification et caractérisations chimique et fonctionnelle de la purine-cytosine perméase de la membrane plasmique de la levure Saccharomyces cerevisae

par Benoît Pinson

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et médicales

Sous la direction de Jean Chevallier.

Soutenue en 1996

à Bordeaux 2 .


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  • Résumé

    L'objectif de ce travail est l'étude biochimique et bioénergétique du mécanisme moléculaire de fonctionnement de la Purine-Cytosine Perméase (PCP), protéine intrinsèque de la membrane plasmique de la levure Saccharomyces cerevisiae qui catalyse l'entrée dans la cellule de trois bases purines (adenine, hypoxanthine et guanine) et de la cytosine. La PCP solubilisée par un détergent non ionique a pu être purifiée par chromatographie d'affinité, soit par une colonne de chélate de nickel en travaillant avec une forme modifiée de la protéine (six résidus histidyles ajoutés à son extrémité C-terminale), soit sur une colonne d'immunoaffinité construite avec un anticorps anti-C terminal, mais en travaillant cette fois-ci avec la forme sauvage du transporteur. Ces deux approches ont permis d'obtenir des échantillons de PCP pure à 90 %, et l'analyse de la séquence de la protéine purifiée nous a montré que cette protéine avait son extrémité N-terminal bloquée. L'immunoprécipitation de la PCP après des marquages in vivo des proréines cellulaires avec de l'ortophosphate radioactif a permis de mettre en évidence que la PCP est phosphorylée. Cette phosphorylation se produit sur des résidus séryles au cours du trafic des protéines entre l'appareil de Golgi et la membrane plasmique ou dans cette membrane elle même. La fusion (par congélation décongélation et extrusion) de préparations enrichies en membranes plasmiques de souches surexprimant la PCP et de protéoliposomes contenant la cytochrome c oxydase a permis d'obtenir des vésicules closes dans lesquelles nous avons pu générer une différence de potentiel électrochimique transmembranaire en protons. Ce système artificiel a permis de prouver que la PCP est un transporteur actif secondaire qui catalyse un symport proton/base et qui utilise principalement la composante chimique de la force proton-motrice.

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Informations

  • Détails : 192 f

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université de Bordeaux. Direction de la Documentation. Bibliothèque des Sciences du Vivant et de la Santé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : CMTB 1996-443
  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire de santé (Paris). Pôle pharmacie, biologie et cosmétologie.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : MFTH 4584
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