Etudes structurale et fonctionnelle de la pyruvate : ferrédoxine oxydo-réductase et de certains transporteurs d'électrons chez Desulfovibrio africanus

par Laetitia Pieulle

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et microbiologie

Sous la direction de C. HATCHIKIAN.

Soutenue en 1996

à Aix-Marseille 1 .


  • Résumé

    Chez les organismes anaerobies stricts et quelques microorganismes aerobies, la decarboxylation oxydative du pyruvate en acetyl-coa et co#2 est catalysee par la pyruvate: ferredoxine/flavodoxine oxydoreductase (por). Jusqu'a present, cet enzyme a ete isole a partir de quelques microorganismes appartenant a des regnes tres differents allant des archae jusqu'aux protozoaires. Chez les bacteries anaerobies strictes telles que les bacteries sulfato-reductrices (bsr), la por joue un role majeur car elle est impliquee dans la reaction phosphoroclastique qui permet a ces microorganismes de se procurer de l'energie par phosphorylation au niveau du substrat. Nous avons purifie et caracterise la por d'une bsr desulfovibrio africanus. Contrairement aux por des autres organismes anaerobies, la por de d. Africanus est stable vis a vis de l'oxygene au cours de la purification en conditions aerobies. L'enzyme est un homodimere de 270 kda qui possede une molecule de thiamine pyrophosphate (tpp) par sous-unite enzymatique. La por possede egalement comme cofacteur trois centres 4fe-4s par sous-unite dont les potentiels de demi-reduction sont: -390, -515 et -540 mv. Nous avons mis en evidence l'existence de trois etats d'activite de la por de d. Africanus: un etat desactive que l'on observe en purifiant l'enzyme en presence d'oxygene et qui possede une activite specifique de 14 u/mg, un etat actif que l'on obtient en incubant l'enzyme en presence de reducteurs de ponts disulfures tels que le dithioerythreitol ou la thioredoxine, dont l'activite specifique est de 70 u/mg et enfin, un etat inactif irreversible qui est obtenu lorsque l'etat actif de l'enzyme est mis en presence d'oxygene. L'etude du mecanisme reactionnel de l'enzyme par spectroscopie rpe a montre qu'un radical libre etait forme au cours du processus catalytique. Ce radical libre est un intermediaire reactionnel entre le pyruvate et l'acetyl-coa. Les deux electrons produits au cours du processus catalytique seraient ensuite transferres a la ferredoxine i ou ii de d. Africanus. En effet, l'etude de la specificite de la por vis a vis des transporteurs naturels d'electrons a montre que l'activite maximum est detectee en presence de ces deux ferredoxines. De plus, cette etude nous a conduit a purifier et caracteriser trois cytochromes de type c de desulfovibrio africanus. La determination de la structure primaire de la por de d. Africanus a permis de montrer que cet enzyme possede au moins deux domaines fonctionnels situes dans la partie c-terminal de la proteine. Un premier domaine comprend huit residus de cysteines organises en motif caracteristique de l'attachement de deux centres 4fe-4s de type ferredoxine. Ce domaine serait donc implique dans la chelation de deux des trois centres fe-s caracterises biochimiquement. Le troisieme centre serait chelate par quatre cysteines organisees en cluster atypique et situees egalement du cote c-terminal de la proteine. Le deuxieme domaine possede un tripeptide gdg retrouve dans la majorite des decarboxylases et serait donc implique dans l'association du tpp a l'enzyme. Des etudes de cristallisation de la por ont permis l'obtention de cristaux qui diffractent aux rayons x a 3,4 a de resolution. La resolution de la structure tridimensionnelle de cet enzyme est actuellement en cours


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