Etude des structures fonctionnelles de l'aspartyl-trna synthetase. Determination des bases moleculaires de la reconnaissance enzyme-substrats

Studies of the functional conformations of aspartyl-trna synthetase. Molecular basis of the enzyme-substrates specific recognition

• Auteur / Autrice : Franck Martin
• Direction : Jacques Gangloff
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1995
• Etablissement(s) : Strasbourg 1

Résumé

Ce memoire porte sur l'etude des relations structure-fonction des aminoacyl-trna stynthetases (aars). Notre attention s'est focalisee sur l'aspartyl-trna synthetase (asprs) ; nous nous sommes attache a localiser et a caracteriser les interactions de l'asprs avec ses trois substrats a savoir: l'acide aspartique, l'atp et surtout le trna#a#s#p. La structure cristallographique du complexe asprs-trna#a#s#p de la levure saccharomyces cerevisiae a ete resolue et l'etude, par mutagenese dirigee, des residus de l'asprs les plus conserves au sein des enzymes de la classe ii ont conduit a un modele moleculaire du site actif de cette aars de la classe ii. Dans un deuxieme volet, notre interet s'est porte sur l'asprs de e. Coli ; par comparaison avec l'asprs de levure, nous voulions determiner le degre de conservation des bases moleculaires de la reaction d'aspartylation au cours de l'evolution. A cet effet, une etude structurale et fonctionnelle a ete engagee sur le complexe asprs-trna#a#s#p de e. Coli. La structure, resolue dans le laboratoire du dr dino moras, revele la presence d'un domaine additionnel insere entre les motifs 2 et 3, de structure globulaire, specifique des asprs procaryotiques ; il semble etre implique dans des interactions avec le trna au niveau du bras accepteur. Par la suite nous avons aborde l'etude de la specificite de reconnaissance entre le trna#a#s#p et l'asprs de e. Coli. Par un crible genetique, dix mutants d'asprs capables de charger un trna#a#s#pcua ont ete selectionnes. Ces etudes ont contribue a la validation du modele structural du complexe asprs-trna#a#s#p elabore dans le laboratoire du dr. Dino moras et plus particulierement de preciser le role de l'anticodon dans la specificite de reconnaissance de l'asprs. Un autre crible genetique nous a permis d'isoler des molecules d'asprs ayant change de specificite vis a vis du trna, c'est-a-dire capable de reconnaitre le trna#a#s#n#c#u#a. La majorite de ces mutants comportent des deletions plus ou moins importantes du domaine n-terminal ce qui suggererait la presence d'elements antideterminant diriges contre le trna#a#s#n, dans cette region de la proteine. Enfin, nous nous sommes interesse a la specificite de reconnaissance des trna#a#s#p et trna#a#s#n au travers de leur trna suppresseurs d'un codon ambre. Deux cribles genetiques ont conduit a la selection de 19 mutants de trna#a#s#n#c#u#a et de 15 mutants de trna#a#s#p#c#u#a actifs in vivo. Les mutants de trna#a#s#n#c#u#a sont exclusivement aminoacyles par la glnrs alors que les mutants du trna#a#s#p#c#u#a sont reconnus par la lysrs, l'alars, la glnrs et l'argrs. Ces etudes ont confirme le role de plusieurs nucleotides dans l'identite de l'alanine (g3-u70), l'arginine (a20), lysine (u35) et glutamine (u35 et paire de base 1-72) et ont suggere l'existence d'autres elements d'identite pour la lysrs et l'alars