Conception et validation d'un dispositif de culture en perifusion. Application aux cellules hypophysaires en culture tridimensionnelle

par REMY LE GUEVEL

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de J. DUVAL.

Soutenue en 1995

à Rennes 1 .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    De nombreux dispositifs de perifusion, permettant de suivre la dynamique de liberation hormonale par des cellules en culture, ont deja ete decrits. La plupart ne permette cependant que des perifusions de quelques dizaines d'heures, ce qui est bien insuffisant pour des etudes necessitant des durees d'experimentation plus longues. Nous avons donc concu et mis au point un appareil permettant des perifusions pendant plusieurs semaines. Le principe repose sur l'utilisation d'une chambre milicell comme support de culture cellulaire ; ce principe a ensuite ete etendu a l'utilisation de boite de culture de 35 mm de diametre. Le dispositif devant etre autonome, il est pourvu de son propre systeme de regulation de temperature par bain d'huile thermostate et, etant protege des contaminations bacteriennes, il peut etre utilise en dehors d'une salle de culture. Dans la premiere partie de ce travail nous decrivons l'etude realisee sur des prototypes de chambres de perifusion en resine inclusal. Ces prototypes nous ont permis d'optimiser les caracteristiques physiques de la chambre de perifusion avec, entre autre, une amelioration sensible des performances thermiques. A partir des resultats obtenus sur les prototypes, nous avons fait fabriquer un appareil standard en plexiglas. Les premiers resultats obtenus avec cet appareil ont revele que des cellules hypophysaires de rat en culture tridimensionnelle pouvaient etre perifusees pendant au moins deux semaines avec maintien de la liberation basale de lh, de prl et de sgii. Dans la deuxieme partie de ce travail, nous avons mis au point un dosage elisa de la sgii de rat (rsgii), ce dosage devant permettre la quantification de la rsgii dans les milieux de perifusion. Ce dosage elisa permet de doser la rsgii dans des milieux de culture ou dans des extraits cellulaires dans une gamme de 50 a 1000 mg de rsgii-rp. Il n'est pas suffisamment sensible cependant pour le dosage de la proteine dans le serum. Dans la troisieme partie de ce travail, nous avons etudie le comportement d'agregats de cellules hypophysaires de rats en perifusion continue en parallele avec des cellules maintenues en cultures statisques. Les resultats de cette etude ont montre que: 1- la perifusion n'affecte pas l'incorporation de #-#3#5smet par rapport a des cellules temoins ; 2- la liberation basale de lh est faible et constante pendant toute la duree de la perifusion, mais cette liberation est cependant plus importante pour les agregats perifuses ; 3- la liberation de la prl presente une phase de croissance pendant 3 a 4 jours, puis oscille fortement autour d'une valeur plateau sans qu'il soit observe une difference de liberation avec les agregats temoins ; 4- le contenu intracellulaire en lh et sgii est legerement plus faible dans les agregats perifuses tandis que le contenu en cga est lui tres fortement diminue ; la prl intracellulaire n'est pas affectee par la perifusion. Nous avons ensuite realise l'etude pharmacodynamique d'un agent dopaminergique: le cv205-502 (sandoz). Les resultats de cette etude ont montre un effet different selon les conditions de traitement. Un traitement continu a la concentration de 10#-#9m en culture statique provoque une inhibition de liberation de prl pendant la duree d'administration avec retour a la secretion basale apres retrait de l'analogue, tandis qu'en perifusion continue, l'inhibition persiste 3 a 4 jours apres l'arret du traitement. Cet effet prolonge est aussi observe avec un autre analogue dopaminergique, la bromocriptine


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Informations

  • Détails : 169 P.
  • Annexes : 151 REF.

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