Synthese d'atp par des proteoliposomes couplant la bacteriorhodopsine a l'atp synthase de la bacterie thermophile bacillus ps3

par Bruno Pitard

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de J.-L. RIGAUD.

Soutenue en 1995

à Paris 11 .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    L'objet de ce travail est l'etude des relations structure-fonction des atp synthases a protons (f#0f#1) des membranes transductrices d'energie, par reconstitution en liposomes. Sous l'effet d'un gradient electrochimique transmembranaire de protons ces enzymes synthetisent l'atp a partir d'adp et de phosphate inorganique. La reaction inverse d'hydrolyse d'atp genere un gradient electrochimique de protons. Ces proteines membranaires sont constituees de deux composants, f#1 et f#0. Le composant f#1 contient les protomeres catalytiques, et peut etre isole sous forme d'une atpase possedant une haute activite d'hydrolyse d'atp. F#0 est localise dans la membrane, et assure la translocation des protons vers la partie extrinseque f#1. La reaction de synthese d'atp necessite la presence de ces atp synthases dans des structures vesiculaires scellees. A cause de la complexite des membranes natives transductrices d'energie, il est apparu necessaire de mettre au point des systemes modeles en liposomes contenant les atp synthases purifiees. Afin d'obtenir des proteoliposomes contenant la bacteriorhodopsine et l'atp synthase (tf#0f#1) extraite de la bacterie thermophile bacillus ps3, nous avons applique un protocole de reconstitution de proteines membranaires, base sur l'idee que la solubilisation des liposomes par des doses croissantes de detergent et la reconstitution de liposomes par elimination de celui-ci a partir d'une suspension micellaire sont deux processus inverses. Ce protocole a permis l'obtention de proteoliposomes co-reconstitues synthetisant jusqu'a 800 nmoles d'atp/min. Mg tf#0f#1. L'analyse rationnelle des differents parametres impliques dans les experiences de co-reconstitution a permis de differencier les parametres influencant la reconstitution (association lipides/proteines, incorporation, orientation des proteines) des parametres agissant sur l'activite intrinseque de l'atpase (stimulation/inhibition) ou des parametres affectant le couplage entre la bacteriorhodopsine et l'atp synthase (gradient electrochimique de protons, changement de permeabilite de proximite des deux proteines). Ensuite, les resultats obtenus indiquent qu'avec un systeme co-reconstitue bien caracterise il est possible d'entreprendre des etudes sur les mecanismes moleculaires de la synthese d'atp. En particulier, la stoechiometrie proton/atp, a ete determinee en comparant les forces thermodynamiques (energie libre de gibbs de la reaction de phosphorylation et gradient electrochimique de protons) estimees dans des conditions d'equilibre. Une stoechiometrie de 4 a ete trouvee, c'est-a-dire qu'il faudrait 4 protons pour synthetiser ou hydrolyser une molecule d'atp. De plus, le role des sites de fixation des nucleotides dits non catalytiques, situes essentiellement sur les sous-unites portees par la partie f#1, dans la synthese d'atp etait reste jusqu'a ce jour obscur. Un de ces sites possede, sur l'atp synthase extraite de la bacterie thermophile bacillus ps3, un role de regulation de la synthese d'atp ; lorsque ce site est rempli avec de l'atp la synthese d'atp est stimulee

  • Titre traduit

    Atp synthesis by co-reconstituted proteoliposomes containing bacteriorhodopsin and atp synthase from thermophilic bacillus ps3


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  • Détails : 2 VOL.,307 P.
  • Annexes : 384 REF.

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