L'aspartyl-arnt synthetase des eucaryotes : relations structure-fonctions liees a l'acquisition de domaines polypeptidiques impliques dans l'adressage de cet enzyme a d'autres constituants cellulaires

par Fabrice Agou

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de M. MIRANDE.

Soutenue en 1995

à Paris 11 .

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  • Résumé

    Les aminoacyl-arnt synthetases catalysent l'aminoacylation specifique des arn de transfert. Cette these est une contribution a la caracterisation structurale et fonctionnelle des aminoacyl-arnt synthetases chez les eucaryotes. Celles-ci se differencient de leurs homologues bacteriennes par leur aptitude a se lier a des supports polyanioniques, a s'associer sous forme de complexes multienzymatiques ou a former des proteines multifonctionnelles. L'evolution structurale de cette famille d'enzyme est a mettre en parallele avec le haut niveau d'integration cellulaire de l'appareil de biosynthese des proteines chez les eucaryotes superieurs. L'aspartyl-arnt synthetase (asprs) a ete etudiee en tant que systeme modele pour la definition de motifs structuraux impliques dans des interactions avec d'autres composantes cellulaires. L'etude structurale, par dichroisme circulaire et rmn, d'un peptide representant l'extension polycationique amino-terminale de l'asprs de levure a montre que la neutralisation des chaines laterales des residus lysine par deprotonation a ph basique ou par formation d'un complexe de haute affinite avec un polyphosphate p#1#8 permet de structurer le tricosapeptide en helice , revelant une distribution anisotrope des residus basiques. Une telle structuration du domaine n-terminal de l'enzyme permettrait de former une surface d'interaction ideale envers des supports polyanioniques. Un role de ces extensions dans l'adressage des synthetases de levure au voisinage des sites de proteosynthese, a ainsi ete suggere. Chez les mammiferes, l'asprs fait partie d'un complexe multienzymatique de haut poids moleculaire. La grande similitude des structures primaires des asprss de levure et de mammifere a permis de modeliser les elements structuraux de l'enzyme de rat d'apres les coordonnees cristallographiques de l'enzyme de levure. La structure exon/intron du gene drs1 a ete correlee a la structure de la proteine. Cette analyse a conduit a mettre en evidence plusieurs caracteristiques essentielles de l'agencement exon/intron des genes morceles, en relation avec l'evolution des aminoacyl-arnt synthetases de classe ii. L'asprs de rat se distingue de son homologue de levure par une extension amino-terminale plus apolaire, impliquee dans son adressage au complexe multienzymatique. Afin d'etudier les proprietes d'association de cet enzyme, l'asprs recombinante native, exprimee dans le levure a partir de son adnc, a ete purifiee a homogeneite. De meme, des mutants de deletion ainsi que des variants portant des mutations ponctuelles dans le domaine n-terminal de l'enzyme, ont ete isoles. Les activites catalytiques de ces formes enzymatiques, determinees pour la reaction d'aminoacylation de l'arnt, sont indistinguables, soulignant l'independance du domaine catalytique et du domaine d'association de cet enzyme. Les proprietes cinetiques, hydrodynamiques et de fluorescence intrinseque de ces proteines recombinantes ont permis d'etablir une correlation entre activite enzymatique et etat dimerique de la proteine. Nous montrons que le domaine n-terminal de l'asprs de rat contribue a la stabilisation du dimere. Les differentes formes enzymatiques ont ete testees pour leur capacite a s'associer au complexe multienzymatique. Un test d'echange enzyme libre/enzyme associe a ete developpe, permettant de mesurer l'affinite relative de ces mutants vis-a-vis du complexe. Les resultats montrent que le segment comprenant les residus 11 a 30 de l'extension n-terminale de l'asprs de rat, susceptible de former une helice amphiphile, est un des elements cles de cette association


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  • Détails : 203 P.
  • Annexes : 316 REF.

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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2014-012215
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