Coupure en trans par le ribozyme du virus de l'hépatite delta

par FRANCK LESCURE

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Marc Vasseur.

Soutenue en 1995

à Paris 6 .

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  • Résumé

    Le virus de l'hepatite delta (vhd) est un virus a arn (-) humain qui provoque des hepatites graves. A l'image de certains pathogenes de plante et de facon unique dans le monde animal, la replication de son genome se fait selon un mecanisme en cercle roulant utilisant des matrices arn. Ce procede replicatif est associe a l'apparition de multimeres genomiques et antigenomiques convertis en monomeres par un clivage autocatalytique de l'arn. Le ribozyme mis en jeu se distingue cependant des motifs en tete de marteau et en epingle a cheveux determines jusqu'alors chez les pathogenes vegetaux. Dans l'espoir de developper un ribozyme delta catalysant la coupure en trans d'arn heterologues, nous nous sommes tout d'abord interesses a l'efficacite d'autocoupure du fragment minimal actif derive du genome du vhd. Ce 89-mere s'autocoupe tres efficacement a 37c, ce qui nous a permis d'envisager certaines modifications structurales importantes du motif. C'est ainsi que plusieurs constructions multimoleculaires ont ete testees. La plus active de ces formes correspond a un complexe bimoleculaire constitue d'un arn ribozyme de 74 nucleotides de long catalysant en trans la coupure site-specifique d'un arn substrat de 14 nucleotides de long. Le systeme genomique a ensuite ete analyse en le comparant systematiquement a son equivalent antigenomique, qui presente dans les memes conditions reactionnelles une plus grande efficacite catalytique. Des homodimeres stables du substrat et des conformations inactives mono- et multimoleculaires stables du ribozyme ont pu etre mis en evidence, specifiquement dans le cas du systeme de coupure en trans genomique. Leur existence pourrait limiter l'activite in vitro. La sequence du ribozyme genomique a donc ete modifiee en remplacant les domaines theoriquement impliques dans la formation de ces structures alternatives par leur equivalent antigenomique. La construction de ces ribozymes chimeres a permis d'ameliorer l'activite genomique en trans et d'identifier les elements conformationnels limitants. D'autres constructions chimeres ont ete fabriquees. Leur analyse permet de comprendre un peu mieux les contraintes liees au systeme ribozymique actif en trans. Enfin, les resultats obtenus a l'issue d'analyses par photoaffinite intrinseque des proximites moleculaires au sein du complexe bimoleculaire antigenomique suggerent une legere correction des hypotheses structurales proposees precedemment au sujet de l'organisation en pseudonud du motif delta


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Informations

  • Détails : 192 P.
  • Annexes : 194 REF.

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  • Cote : PMC RT P6 1995
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