La proteine tat du virus vih-1 : expression chez escherichia coli, purification et activite

par HELENE DUPLAN CHANUT

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de J.-M. MASSON.

Soutenue en 1995

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    La proteine tat du virus vih-1 est un trans-activateur puissant permettant la surexpression de tous les genes viraux, par l'intermediaire de sa cible arn, tar, situee dans le ltr 3' du virus. L'objectif premier de ce travail a ete de purifier la proteine tat sous forme native correctement repliee afin de tester son activite biologique. Differents systemes d'expression et schemas de purification ont ete etudies, dans lesquels l'usage d'agents denaturants a ete proscrit, car la renaturation d'une telle proteine genere le plus souvent un melange en partie inactif. Le gene tat a ete clone et exprime chez e. Coli, seul ou en fusion avec les genes de la glutathione s-transferase (gst) ou de la beta-galactosidase. Seule la fraction de proteine tat soluble, non agregee est utilisee dans les procedures de purification. Par rapport a tat, les niveaux d'expression et de solubilite de la fusion gst-tat sont significativement ameliores (7-8% des proteines totales, dont 80% solubles). Toutefois, l'utilisation de la beta-galactosidase en tant qu'etiquette de purification par affinite s'est averee plus efficace et specifique que la gst. La mise au point de la chromatographie d'immunoaffinite a finalement permis d'isoler tat, non fusionnee ou issue du clivage de la fusion beta-gal-tat par la thrombine, a plus de 90% de purete. Les differents echantillons de tat ont ete testees in vitro pour determiner leur capacite, d'une part a interagir avec tar, et d'autre part a trans-activer l'expression du gene rapporteur cat dans des cellules hela en culture. Les differentes voies de production de tat ne sont pas strictement equivalentes en terme d'activite biologique. Toutes les formes presentent une certaine activite trans-activatrice mais les resultats les plus coherents entre les deux tests sont obtenus avec la proteine non fusionnee. Ceci indique que le repliement de tat, implique dans son activite biologique, est probablement modifie par son partenaire de fusion. Des etudes preliminaires montrent par ailleurs que la proteine tat purifiee exogene est capable d'activer des cellules endotheliales, en provoquant leur adhesion a une lignee de macrophages en synergie avec le tnf-alpha. Tat pourrait ainsi jouer un role indirect dans l'inflammation et eventuellement dans la dissemination des tumeurs, associees a l'infection par le virus


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Informations

  • Détails : 198 P.
  • Annexes : 340 REF.

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 1995/337/DUP
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