Clonage, expression et caracterisation des facteurs proteiques de l'activation de la nadph oxydase des neutrophiles. Mises en evidence de domaines specifiques d'interaction

par ALEXANDRA FUCHS

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de P. VIGNAIS.

Soutenue en 1995

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    Les neutrophiles constituent la premiere ligne de defense contre les pathogenes d'origine bacterienne ou fongique. Leur capacite a tuer les microorganismes au niveau de foyers d'infection depend pour une large part du fonctionnement d'un systeme enzymatique producteur d'ions sueproxyde o#2#-, le complexe nadph oxydase, forme d'un flavocytochrome b heterodimerique qui reside dans la membrane plasmique. Ce composant redox transporte les electrons du nadph vers l'oxygene via un fad et un heme de type b sous le controle de la proteine g monomerique geranyl-geranylee rac suite au transfert des proteines cytosoliques, p67phox, p47phox, p40phox. Le travail experimental presente dans ce memoire porte sur 1) les parametres moleculaires et topographiques relatifs a rac, pour une activation maximale de l'oxydase en milieu acellulaire: p47phox, p67phox et rac1 ont ete clonees et surexprimees dans le systeme d'expression cellules d'insecte/baculovirus puis purifiees et utilisees avec une preparation de membranes de neutrophiles pour etudier l'activation de la nadph oxydase. Le role de la geranyl-geranylation post traductionnelle de rac et de la nature du guanine-nucleotide fixe par rac a ete precise. 2) la localisation des zones d'interaction dans p47phox, p67phox et p40phox proteines riches en domaines sh3 et motifs polyproline lors de l'assemblage du complexe oxydase, grace a l'utilisation d'un systeme de clonage par interaction in vivo, le systeme double-hybride: l'emploi de differentes constructions impliquant les proteines p47, p67 et p40 entieres ou tronquees a conduit a localiser plusieurs sites specifiques d'interaction et a permis de construire un modele du complexe oxydase faisant apparaitre de facon coherente les assemblages des composants du complexe, ainsi que leur evolution au cours de l'activation


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  • Détails : 153 P.
  • Annexes : 138 REF.

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