Clonage et analyse des genes de rhodococcus sp. Acv2 codant pour la degradation de l'adiponitrile. Localisation chromosomique. Construction de vecteurs de clonage

par FREDERIC BIGEY

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de A. ARNAUD.

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  • Résumé

    La souche mutante, rhodococcus sp. Acv2 est capable d'hydrolyser l'adiponitrile en adipate d'ammonium plus efficacement que la souche sauvage rhodococcus sp. R312. Sa nitrile hydratase est capable d'hydrater plus rapidement les mononitriles issus de l'adiponitrile. Il convenait de determiner la structure primaire de l'enzyme. Une banque cosmidique a ete construite chez escherichia coli. Le criblage par hybridation sur colonies a l'aide d'une sonde specifique a permis d'isoler un cosmide contenant le gene de la nitrile hydratase. Le sequencage d'un fragment de 1,7 kb a permis d'identifier les genes ntha et nthb codant pour les deux sous-unites de l'enzyme et de reperer une mutation affectant le gene nthb. Cette mutation se traduit, au niveau du 40#i#e#m#e acide amine de la sous-unite beta, par le remplacement d'une methionine par une valine chez la souche mutante acv2. Une sequence conservee, susceptible d'etre le site de fixation de l'atome de fer des nitrile hydratases, a ete reperee au niveau de la sous-unite alpha. Les plasmides pbl33 et prc1 de brevibacterium linens atcc 9174 et rhodococcus rhodochrous atcc 4276 ont ete employes pour construire des vecteurs navettes entre rhodococcus sp. Et e. Coli. Les plasmides construits, psp33 (replicon de pbl33) et pspc1 (replicon de prc1), porteurs du gene de resistance aphl provenant du transposon tn903, conferent la resistance a la neomycine a rhodococcus sp. R312. Ces plasmides devraient permettre le transfert des genes clones chez rhodococcus sp. Une etude du genome de rhodococcus sp. R312 par electrophorese en champ pulse a ete realisee. La taille du chromosome est estimee a 6,44 mb. Les genes ntha et nthb ainsi que le gene amie codant pour l'amidase generale ont ete localises sur des fragments de restriction. Ces travaux constituent une etape preliminaire a l'elaboration d'une carte physique du chromosome de rhodococcus sp. R312

  • Titre traduit

    Cloning, analyzing of the rhodococcus sp. Acv2 genes coding for the degradation of adiponitrile. Chromosomal location of the genes. Construction of cloning vectors


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  • Détails : 126 P.
  • Annexes : 165 REF.

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