Contribution au clonage de l'adnc correspondant a la dihydroxyacetone-phosphate acyl-transferase (dhap-at), une enzyme de la membrane des peroxysomes

par CATHERINE CAUSERET

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de M. BUGAUT.

Soutenue en 1995

à Dijon .

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  • Résumé

    La dihydroxyacetone-phosphate acyl-transferase (dhap-at) est une enzyme de la membrane du peroxysome quantitativement mineure. Elle catalyse la premiere etape de biosynthese des ether-lipides (plasmalogenes), formant l'acyl-dhap, intermediaire obligatoire de ces composes. Cette activite enzymatique est deficiente dans des maladies peroxysomales telles que le syndrome de zellweger, dans lesquelles les taux de plasmalogenes sont tres bas. L'isolement de l'adnc correspondant a la dhap-at est donc d'une grande importance pour etablir la nature exacte de cette deficience. Dans ce but, nous nous sommes proposes de purifier l'enzyme et de la microsequencer en vue d'obtenir des oligonucleotides utilisables comme sonde pour cribler une banque d'adnc. L'activite specifique de la dhap-at dans les peroxysomes de foie de rat n'est pas augmentee suite a un traitement de 15 jours avec du fenofibrate ou du ciprofibrate, deux hypolipemiants proliferateurs de peroxysomes. Par contre, l'activite enzymatique peroxysomale totale (mesuree a ph 5,5) est multipliee 11 fois avec le fenofibrate et 7 fois avec le ciprofibrate. Le foie de rats traites par le fenofibrate a donc ete choisi comme materiel de depart pour la purification de la dhap-at. Les proteines membranaires de peroxysomes purifies ont d'abord ete solubilisees avec du chaps puis fractionnees sur 4 colonnes chromatographiques. Une fraction proteique enrichie 4000 fois en activite dhap-at a ete obtenue. Deux bandes principales (64 et 74 kda) etaient visibles en page-sds. Le microsequencage de la bande de 64 kda a permis de disposer d'un peptide de sequence inconnue dans les banques de donnees, utilisable pour la synthese d'une sonde oligonucleotidique peu degeneree. En northern blotting, cette sonde s'hybride a un transcrit de 3,3 kb dans le cur de rats normaux. Le traitement par le fenofibrate n'a aucune influence sur le taux de ce transcrit. Le criblage par pcr d'une banque d'adnc de cur est en cours


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  • Détails : 135 P.
  • Annexes : 192 REF.

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