Etude des conditions experimentales de la transformation genetique d'embryons zygotiques chez arabidopsis thaliana l. Genotype c24 et essais d'extension a d'autres especes vegetales

par YVAN BOURGEOIS

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de BRIGITTE SANGWAN.

Soutenue en 1996

à Amiens .

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  • Résumé

    Nous avons mis au point un protocole efficace de regeneration chez arabidopsis thaliana a partir d'embryons zygotiques immatures. Divers milieux de culture ont ete testes. Des plantes morphologiquement normales et fertiles ont ete regenerees a partir des cals issus des embryons mis en culture. Nous avons montre que l'efficacite de la regeneration est maximale quand les embryons sont places, tout d'abord, sur un milieu callogene a forte concentration en auxine et a faible concentration en cytokinine, puis transferes sur un milieu organogene a forte concentration en cytokinine et a faible concentration en auxine. Dans ces conditions, les taux de regeneration obtenus sont superieurs a 85%. Des analyses en cytofluorimetrie de flux ont montre que les plantes regenerees a partir de ce protocole etaient a plus de 95% diploides. L'efficacite du protocole de regeneration mis en place nous a permis, par la suite, d'etablir un systeme de transformation genetique par agrobacterium tumefaciens a partir d'embryons zygotiques, qui a conduit a des taux de transformation superieurs a 75%. Les plantes regenerees a partir des cellules transformees sont obtenues en 7 a 8 semaines et des etudes genetiques et de biologie moleculaire ont confirme l'etat transgenique de ces plantes. L'etude de l'influence de divers parametres du protocole nous a permis de montrer l'importance d'un pretraitement hormonal des embryons zygotiques avant leur transformation, traitement hormonal qui entrainerait un etat de competence a la transformation genetique des cellules vegetales. Nos etudes ont montre, aussi bien pour les embryons zygotiques que pour les cotyledons, les feuilles ou les racines, que les cellules aptes a la transformation genetique par agrobacterium tumefaciens etaient de type dedifferencie : cellules de petite taille, isodiametriques, a noyau proeminent et a fine paroi cellulaire. Les analyses morphologiques de la descendance des plantes transgeniques ont permis de montrer que certaines variations auraient pour origine des alterations transitoires liees a la culture in vitro. D'autres variations semblent provenir de mutations non liees au t-dna. Seul le phenotype d'une plante pourrait correspondre a une mutation liee a l'insertion du t-dna. Cette plante presente des aberrations morphologiques avec des feuilles, epaisses et aux bords dentes, des fleurs avec des sepales et des petales atrophies ainsi qu'un pistil presentant un enroulement plus ou moins prononce. A partir du systeme de transformation etabli chez arabidopsis thaliana, nous avons pu transformer des cellules d'embryons zygotiques chez le colza, la luzerne, le petunia, la tomate. Ces resultats permettent d'envisager l'application de notre protocole de transformation a d'autres especes vegetales.


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  • Détails : 139 P.
  • Annexes : 145 REF.

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