Biosynthese du d-glutamate, precurseur du peptidoglycane chez escherichia coli

Biosynthesis of d-glutamate, peptidoglycan precursor in escherichia coli

• Auteur / Autrice : Patricia Doublet
• Direction : Dominique Mengin-Lecreulx
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1994
• Etablissement(s) : Paris 11

Résumé

Le d-glutamate est un composant specifique du peptidoglycane, polymere essentiel de la paroi bacterienne. Deux types d'enzymes catalysent la biosynthese de ce d-aminoacide: soit une d-ala-d-glu transaminase observee chez bacillus, soit une glutamate racemase identifiee chez lactobacillus et pediococcus. Curieusement, cette enzyme n'avait pas ete etudiee chez des especes importantes d'un point de vue clinique, nous nous sommes donc proposes de la caracteriser chez une enterobacterie, escherichia coli. Le gene muri, implique dans la biosynthese du d-glutamate, a ete clone par complementation d'un mutant auxotrophe pour ce d-aminoacide; il correspond a un gene orf1 localise a 90 min sur la carte de e. Coli entre le gene btub qui code pour le recepteur a la vitamine b#1#2 et l'operon rrnb. Il a ete verifie par des experiences de mutagenese insertionnelle que ce gene etait essentiel a la biosynthese du d-glutamate. Le clonage du gene muri sous la dependance d'un promoteur fort a permis, dans un second temps, la surproduction efficace de la proteine muri. A partir d'extraits proteiques realises sur cette souche surproductrice nous avons identifie l'activite enzymatique de cette proteine comme etant une glutamate racemase. Les memes extraits nous ont ensuite permis de purifier a homogeneite cette enzyme et les constantes cinetiques de la reaction, dans l'un et l'autre sens, ont ete determinees. Par des experiences de modification chimique et de mutagenese dirigee, nous avons mis en evidence l'implication de deux residus cysteines dans la catalyse enzymatique, selon un mecanisme reactionnel dit a deux bases. Enfin, de facon tres interessante, nous avons montre que la glutamate racemase de e. Coli etait regulee par l'udp-murnac-l-ala, qui est le substrat sur lequel est ajoute le d-glutamate pour former l'udp-murnac-dipeptide, via l'enzyme murd. Il semble donc que la synthese du d-glutamate soit in vivo tres finement ajustee aux besoins de la cellule en peptidoglycane