Etude de la relation structure-fonction de l'apolipoproteine a2 humaine par production de proteine recombinante

par José López

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de J. CHAMBAZ.

Soutenue en 1994

à Paris 6 .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Pour pouvoir decrypter les relations structure/fonction, l'incidence des modifications post-traductionnelles et l'influence de l'apo a2 sur les differentes activites enzymatiques qui regissent le transport inverse du cholesterol, nous nous sommes attaches a mettre au point un systeme de production d'apo a2 humaine recombinante qui puisse nous permettre d'obtenir des quantites suffisantes de proteines normale et mutee. Pour ce faire, nous avons teste differents systemes de production d'origine eucaryote et procaryote. L'expression de l'apo aii humaine dans la lignee de fibroblastes c127 s'est averee performante pour l'etude des modifications post-traductionnelles de l'apo a2. Ce systeme d'expression eucaryote nous a permis de preciser: 1 - par des experiences en presence de brefeldine a, que la modification precoce, correspondant au passage de l'isoforme 3 a l'isoforme 1, survenait dans le compartiment pregolgien, 2 - et par mutagenese dirigee en substituant la glutamine en position 1 par une leucine, que le passage des isoformes 1a et -1a aux isoproteines 0 et -2 resultait bien de la cyclisation de la glutamine n-terminale et qu'une telle substitution ralentissait fortement le clivage du propeptide. D'autre part, nous avons pu mettre en evidence, une importante degradation intracellulaire de l'apo a2 dans les cellules c127, qui explique a posteriori l'impossibilite d'utiliser ce systeme eucaryote a des fins de production en masse. Nous avons opte, dans un deuxieme temps, pour la production d'apolipoproteine a2 humaine chez e. Coli, sous forme d'une proteine de fusion avec la gluthathion-s-transferase. Ce systeme nous a permis d'obtenir de l'apo a2 recombinante exclusivement dimerique, pure et en quantite suffisante, dont les proprietes physicochimiques et la capacite de deplacement de l'apo a2 sont identiques a celles de l'a2 plasmatique. L'etude de la structure de l'apo a2, de son comportement vis a vis des phospholipides et sa capacite a deplacer l'apo a1 ont ete realises en presence d'apo a2 plasmatique, d'apo a2 recombinante et d'apo a2 produite par synthese chimique. Cela nous a permis de preciser les caracteristiques structurales de l'apo a2 lorsqu'elle est associee aux phospholipides et l'organisation des complexes qu'elle genere. Nous avons montre que deux molecules d'apo a2 dimerique etaient necessaires a la formation de complexes phospholipides-apo a2 stables. De plus, nos resultats experimentaux suggerent la presence de 3 helices alpha par monomere d'apo a2 quand elle se trouve associee aux phospholipides. Ces resultats ont ete obtenus quelque soit la forme d'apo a2 utilisee, plasmatique, procaryote ou synthetique


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Informations

  • Détails : 215 P.
  • Annexes : 299 REF.

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  • Accessible pour le PEB
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : PMC RT P6 1994
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