L'erythropoietine de recombinaison genetique exprimee dans une lignee lymphoblastoide humaine : purification a l'aide d'anticorps monoclonaux et etude des principales proprietes de la proteine recombinante

par AZZA BOUNEMRA-BEN GHANEM

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de P. LAMBIN.

Soutenue en 1994

à Paris 6 .

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  • Résumé

    Des anticorps polyclonaux et monoclonaux necessaires a la purification et a la caracterisation de l'erythropoietine produite dans une lignee cellulaire lymphoblastoide humaine (epohrl) ont ete obtenus par immunisation de lapins et de souris avec de l'epo humaine purifiee. Trois acm (d7, e14 et e73) ont ete selectionnes et leurs constantes de dissociation sont respectivement 0,33 nm, 0,3 nm et 17 nm. Les proprietes immunochimiques de ces acm ont ete analysees a) detection par des techniques de western blot: seul l'acm d7 s'est revele efficace. B) purification: les meilleurs resultats sont observes avec l'acm e14. C) inhibition de l'activite biologique: la liaison specifique de l'epoh a son recepteur cellulaire est inhibee par les acm e14 et e73. Ces acm inhibent egalement la proliferation d'une lignee cellulaire dependante de l'epo (lignee ut-7). D) les combinaisons de ces anticorps monoclonaux ainsi que ceux fournis par d'autres laboratoires ont ete etudies en vue du dosage immunochimique de l'epo. Parallelement a ces travaux sur les acm, l'epo a ete exprimee dans une lignee cellulaire lymphoblastoide humaine. Un vecteur integratif comportant le gene de l'epo humaine ainsi que le systeme d'expression et d'integration du gene a ete construit puis introduit par electroporation dans des cellules lymphoblastoides humaines. Les cellules transfectees ont ete clonees puis sous-clonees en fonction de leur capacite a produire l'epo. Un sous-clone stable dans des conditions non selectives est capable de produire environ 30 u. I. /10#6 cellules/24h. Des surnageants contenant 2 000 a 3 000 u. I. /ml ont ete obtenus apres culture. L'epohrl a ete purifiee en deux etapes principales. La premiere etape a ete realisee grace a l'acm e14 immobilise sur sepharose 4b et permet de purifier la proteine plus de 400 fois. La seconde etape consiste en une chromatographie sur deae sephacel. La combinaison de ces deux etapes a permis d'obtenir une epohrl hautement purifiee avec un rendement global superieur a 50%. L'activite specifique de la proteine est de 176 000 u. I. /a#2#8#0. Le spectre en rmn est caracteristique d'une proteine bien structuree de conformation unique. La proteine purifiee a ete analysee par page-sds et isoelectrofocalisation. L'activite biologique de l'epohrl purifiee a ete mesuree in vivo et in vitro et est similaire a celle de l'epo urinaire ou exprimee dans d'autres cellules de mammiferes. Differentes isoformes de la glycoproteine ont ete etudiees. L'ensemble des resultats rapportes dans cette these contribue a la caracterisation d'une epo recombinante humaine exprimee pour la premiere fois dans une lignee cellulaire d'origine humaine non tumorale


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Informations

  • Détails : 215 P.
  • Annexes : 191 REF.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : PMC RT P6 1994
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