Conception d'un système d'expression-purification de protéines de fusion par échange d'ions

par Sylvie Le Borgne

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Jean-Stéphane Condoret.

Soutenue en 1994

à Toulouse, INSA .


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  • Résumé

    Un systeme d'expression-purification de proteines recombinantes intracellulaires chez e. Coli, base sur la technologie des proteines de fusion, a ete developpe. Il comporte une etiquette chargee facilitant la separation par chromatographie d'echange d'ions (cei) et un site de clivage par la thrombine pour recuperer la proteine native apres cei. Six et douze residus d'acide glutamique ou aspartique, suivis du site thrombine, sont fusionnes du cote n-terminal de la beta-galactosidase d'e. Coli utilisee comme proteine modele. Un promoteur inductible a l'arabinose controle l'expression des genes. Les proteines fusionnees ont la meme activite specifique que la beta-galactosidase, mais ont un comportement different en cei. Grace au modele de deplacement stoechiometrique, decrivant l'adsorption des proteines en cei, il est montre que le nombre de points d'attache de (glu)6-site thrombine-beta-galactosidase sur l'echangeur d'ions est identique a celui de la beta-galactosidase, par contre sa constante de liaison au support est plus elevee. Situee en amont du gene de la beta-galactosidase, la sequence n-terminale supplementaire de (asp)6-site thrombine provoque une amplification de l'expression au niveau traductionnel. La presence d'etiquettes chargees facilite la purification de la beta-galactosidase a partir d'extraits bacteriens bruts par cei classique ou sur membranes. Les fusions possedant six residus acides sont clivees par la thrombine, contrairement a celles en possedant douze. L'efficacite du clivage augmente en presence de faibles concentrations en polyethyleneglycol ou glycerol. Ces additifs protegent la thrombine contre la denaturation thermique. Le chlorure de sodium affecte le clivage de (glu)6-site thrombine-beta-galactosidase, alors qu'un effet inverse est note avec un substrat chromogene synthetique

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Informations

  • Détails : 1 vol. ([6]-133 f.)

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 1994/302/LEB
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