Etude de la nucléase majeure de l'enterobactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi : caractérisation génétique et biochimique de l'enzyme NucM

par Mireille Moulard

Thèse de doctorat en Biochimie

Sous la direction de Janine Robert-Baudouy.


  • Résumé

    Afin d'élucider le rôle des nucléases synthétisées par la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, j'ai cloné et séquencé le gène nucM codant pour la nucléase majeure de cette bactérie. Ce gène a été mutagénisé par insertion d'une cassette uidA-KanR L'allèle muté a été recombiné dans le génome d'E. Chrysanthemi, ce qui a permis l'obtention d'une souche mutante dépourvue de cette activité. L'analyse de ce mutant a démontré que la nucléase nucM joue un rôle mineur dans la protection de la bactérie contre l'ADN étranger. Son influence dans le pouvoir pathogène n'a pas pu être démontrée. Le gène nucM semble exprimé constitutivement, cependant son expression est légèrement réprimée par le glucose. Sa transcription est assurée par la polymérase associée au facteur sigma 70, mais les séquences spécifiques de ce promoteur seraient décalées a 12 et 40. La nucléase nucM présente une séquence N-terminale rappelant une séquence signal de sécrétion. Elle a un point isoélectrique basique, ce qui m'a permis de la purifier rapidement sur une colonne sulfopropyl échangeuse de cations, en HPLC, a partir du gène clone chez E. Coli. La nucléase nucM agit sous forme de monomère. Elle présente une forte activité de type endonucléasique sur l'ADN double et simple brin, et possède également une activité ribonucléasique. L'étude de son site actif par action d'inhibiteurs chimiques semble montrer que des résidus histidines de nucM sont impliqués dans la catalyse de la réaction de dégradation.

  • Titre traduit

    = Study of the major nuclease of the phytopathogenic enterobacterium Erwinia chrysanthemi: Genetie and biochemical characterization of the NucM enzyme


  • Résumé

    To elucidate the fonction of the nucleases synthesized by the phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanrhemi, I have cloned and sequenced the nucM gene, coding for the main nuclease of this bacterium. The gene was mutagenized by insertion of a uidA-KanR cassette. The mutated allele has been recombined into the genome of E. Chrysanthemi, which allowed the construction of a strair devoid of this activity. Analysis of this mutant has shown that the NucM nuclease has a minor role in the protection of the bacteria against foreign DNA. Its influence in pathogenicity could not be demonstrated. The nucM gene is expressed constitutively. However, its expression is slightly repressed by glucose. NucM is transcribed by the RNA polymerase associated with the sigma factor 70. However the sequences specific of this factor are shifted upstream at -12 and -40 from the transcription start point. The N-terminus end of NucM looks like a signal sequence. It has a basic isoelectric point, which allowed its easy purification on a sulfopropyl column, from an extract of an E. Coli. Strain containing the cloned gene. NucM is active as a monomer. It possesses a single and double stranded endonucleasic activity and a ribonucleasic activity. Study of the effect of chemical inhibitors indicates that histidine residues could be involved in the catalytic site of NucM.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (197p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr.

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées (Villeurbanne, Rhône). Service Commun de la Documentation Doc'INSA.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : C.83(1631)
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