Developpement du couplage de la chromatographie liquide avec la spectrometrie de masse par l'interface fab a flux continu. Caracterisation des proteines h, t et l du complexe de la glycine decarboxylase des feuilles de pois

par VERONIQUE LOUVET MERAND

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de J. GAGNON.

Soutenue en 1994

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    Au cours de ce travail nous avons utilise differentes techniques de spectrometrie de masse destinees a resoudre des problemes analytiques dans le domaine de la structure des proteines. Dans le but de gagner du temps et de la sensibilite dans les analyses, nous avons developpe le couplage de la chromatographie liquide (hplc) avec la spectrometrie de masse (ms) en mode fab fast atom bombardment par l'interface fab a flux continu (cf/fab). Ce couplage a ete realise avec des colonnes capillaires de diametre interne 0,25 mm. Il s'est avere etre bien adapte a l'etude de melanges complexes de peptides de masses inferieures a 5000 da avec une sensibilite de l'ordre de 20 a 200 pmol pour un peptide de masse 1000 da. Cette sensibilite decroit au fur et a mesure que nous elevons dans le domaine de masse. Par la suite, les techniques de couplage de l'hplc avec la spectrometrie de masse, par l'interface cf/fab mais aussi par l'interface electrospray (esi), ont ete utilisees pour l'etude de la structure primaire et des modifications post-traductionnelles des proteines h, t et l du complexe de la glycine decarboxylase des mitochondries des feuilles de pois. Ainsi, les analyses des fragments issus de coupures chimiques ou enzymatiques des proteines h (14,1 kda) et t (40,9 kda) ont permis de verifier les sequences de ces deux proteines etablies a partir de leurs adnc. Nous avons aussi localiser la position exacte du cofacteur lipoate de la proteine h. La mesure de la masse de la proteine l (49,7 kda) confirme la sequence de la proteine. De plus, elle montre qu'il n'y a de liaison covalente ni entre les deux sous unites de la proteine, ni entre la proteine et son cofacteur, et que la proteine l contient une modification post-traductionnelle de 32 da environ


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  • Détails : 178 P.
  • Annexes : 156 REF.

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