Purification du mlo de la flavescence doree de la vigne par immunoaffinite. Integrite physique et biologique. Etude des principaux constituants

par ABDESSAMAD SEDDAS

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Pierre Pothier.

Soutenue en 1994

à Dijon .

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  • Résumé

    Les mlo demeurent a ce jour non cultivables, et sont difficiles a extraire dans un bon etat de purete et de conservation a partir de leurs hotes (plante et insecte vecteur). Le mlo de la flavescence doree de la vigne (fd-mlo) est experimentalement maintenu au laboratoire dans la feve vicia faba et la cicadelle euscelidius variegatus. La premiere partie de la these a consiste a mettre au point une methode de purification des mlo par immunoaffinite a l'aide des anticorps monoclonaux. Nous avons utilise comme ligand un anticorps monoclonal specifique (51b5) possedant une grande affinite. L'anticorps a ete lie par une liaison covalente sur une matrice synthetique d'hydrazide avid gel (bioprobe), les sites actifs des igg sont orientes vers l'exterieur, les anticorps etant lies par leurs extremites fc. La meilleure elution des mlo a ete obtenue avec un tampon 0,1 m glycine, ph 11,5. L'observation sur la grille au microscope electronique des mlo purifies a ete possible par depot direct des gouttes de l'eluat sur un film de formwar. Les mlo immunopurifies sont en bon etat d'integrite physique. Un test d'infectivite a ensuite ete realise pour tester la pathogenicite des mlo purifies. Ainsi, ces mlo ont ete injectes dans l'abdomen des cicadelles saines (acquisition artificielle). Les cicadelles ont ete deposees sur des plantes saines (v. Faba). Apres 23 jours d'incubation, ces plantes ont montre des symptomes de la flavescence doree. Les cicadelles injectees et les plantes inoculees ont donne des reponses positives en elisa avec des anticorps anti fd-mlo. Les proteines des mlo purifies ont ete analysees par sds-page. Les profils d'immunorevelation avec un anticorps polyclonal anti fd montrent deux bandes majeures dont les masses moleculaires sont voisines de 55 kda et de 19 kda respectivement. Differents anticorps monoclonaux anti fd ne revelent que l'une ou l'autre de ces deux bandes majeures. La caracterisation biochimique des antigenes majeurs a ete abordee. L'adn extrait a partir des mlo purifie apparait exempt d'adn contaminant issu de l'hote. Cet adn a ensuite ete clone dans un vecteur plasmidique. Nous avons selectionne parmi les plasmides recombinants deux inserts d'adn qui ont ete utilises avec succes comme sonde pour detecter les mlo dans les insectes et les plantes malades


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  • Détails : 125 P.
  • Annexes : 136 REF.

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