Expression de cytochromes P-450, de la NADPH cytochrome P-450 réductase et de monooxygénases à flavine par baculovirus recombinants : Une contribution à l'étude du métabolisme des xénobiotiques chez l'homme

par Philippe Clair

Thèse de doctorat en Biochimie. Biologie moléculaire

Sous la direction de Patrick Maurel.

Soutenue en 1993

à Montpellier 2 .

mots clés

• Cytochrome P450
• Monooxygénases
• Oxydoréductases
• Baculoviridés
• Expression génique
• Xénobiotiques -- Métabolisme
• Xénobiotiques -- Détoxication
• Induction enzymatique
• Génie génétique

Résumé

Les produits de plus de 25 genes cytochrome p450 (cyp) et 5 genes flavine monooxygenase (fmo) sont exprimes chez l'homme, et sont responsables du metabolisme de phase i de la plupart des medicaments et xenobiotiques. L'expression par genie genetique d'enzymes humaines clonees repond specifiquement aux problemes d'obtention de materiel enzymatique pur, abondant, et actif necessaire a l'etude du metabolisme des xenobiotiques. Des baculovirus recombinants contenant les cdnas des enzymes cyp3a4, cyp2a6, cyp27, cyp3a6, fmo1, fmo3, fmo4, cytochrome p450 reductase (ncpr) et une cytochrome p450 reductase soluble ont ete construits et les enzymes produites ont ete caracterisees quant a leur taille, leur localisation sub-cellulaire, leur spectre d'absorption et leurs activites enzymatiques en systeme reconstitue. Une optimisation du systeme est decrite qui permet l'incorporation d'heme par l'apoenzyme cyp. Les mesures d'activite cyp2a6 demontrent la labilite de la reductase endogene des cellules hotes sf9 et la necessite de complementer les microsomes sf9 par la ncpr. L'activite des enzymes fmo est etudiee sur plusieurs substrats, ainsi que la stereoselectivite des fmo1 et fmo3 vis-a-vis d'un substrat prochiral. Le systeme baculovirus/sf9 est convenable pour la production d'enzymes fmo et ncpr, et, moyennant quelques adaptations specifiques, pour la production d'enzymes cyp

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