Analyse in situ d'une activité déshydrogenase à l'aide d'un sel de tétrazolium, le MTT : mise au point et applications

par Olivier Huet

Thèse de doctorat en Biochimie et biologie cellulaire

Sous la direction de MARIE-HELENE RATINAND.


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  • Résumé

    De nombreux travaux portent actuellement sur la mise au point de techniques permettant d'analyser des activites biologiques, en particulier oxydoreductrices, in situ. La reduction du mtt, un sel de tetrazolium, est habituellement analysee par spectrophotometrie, pour etudier l'activite deshydrogenase mitochondriale, comme test de proliferation cellulaire ou de cytotoxicite. Cette reaction enzymatique produit des granules sombres de formazan, qui augmentent la refringence cellulaire. Dans ce travail, nous definissons les conditions d'utilisation du mtt et la signification biochimique de sa reduction, pour des analyses quantitatives par cytometrie en flux (cmf), puis nous appliquons cette technique a l'etude du metabolisme energetique de sous-populations de cellules lymphoides. Le taux de reduction du mtt depend de parametres physicochimiques (temperature, ph. . . ) ainsi que des concentrations en tetrazolium et en cellules, et de la composition du milieu nutritif. Il s'agit d'une reaction michaelienne, produite surtout par les deshydrogenases mitochondriales, mais aussi par la glycolyse. Le mtt apparait ainsi comme un colorant non fluorescent, utilisable en cmf pour etudier une activite deshydrogenase coenzyme-dependante, chez des cellules intactes. L'analyse cytometrique de la reduction du mtt, correlee avec des analyses biochimiques et oxymetriques, permet d'observer un metabolisme energetique differemment equilibre selon les sous-populations cellulaires considerees. Ainsi, le metabolisme des splenocytes murins semble plus dependre du chondriome chez les cellules t que chez les b. L'ensemble du metabolisme, glycolytique et mitochondrial, des promyelocytes hl60 diminue lors de leur differenciation granulocytaire. L'activite deshydrogenase de cellules leucemiques l1210 apparait dependre beaucoup de l'activite de leurs mitochondries, mais peu de leur quantite. Enfin, ces cellules presentent une activite deshydrogenase maximale en phase s du cycle cellulaire

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Informations

  • Détails : 178 p
  • Annexes : Bibliogr. p. 163-175. Annexes

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