Preparation et etude par spectroscopie rmn homo et heteronucleaire de proteines de poids moleculaire eleve

par PIERRE LOUIS FORTIER

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Jean-Yves Lallemand.

Soutenue en 1993

à l'EP .

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  • Résumé

    La preparation des echantillons est devenue une etape essentielle dans l'etude des proteines par rmn. A travers trois exemples, nous mettons l'accent sur les problemes rencontres lors de la purification de proteines, et lors de leur expression dans des systemes bacteriens. L'etude par rmn homonucleaire de la calmoduline montre que celle-ci est fortement structuree en helices. Le faible transfert par couplage scalaire ainsi que l'extreme densite de pics de correlation dans les spectres noesy rend l'attribution perilleuse. Afin de clarifier ces spectres, nous developpons une methode qui permet de separer les pics de correlation dans les cartes noesy. La proteine l20, exprimee dans une souche bacterienne, est produite sous forme de corps d'inclusion dans le cytoplasme. Sa purification necessite l'utilisation de conditions denaturantes. Le spectre noesy de la proteine obtenue apres dialyse extensive, montre que celle-ci est partiellement repliee autour d'un noyau hydrophobe. La proteine se denature lentement dans l'echantillon au cours des experiences, ce qui empeche une etude plus poussee de ce repliement partiel. L'etude par rmn homonucleaire du facteur d'initiation 3 d'e. Coli (if3) montre l'existence de deux domaines dans la proteine, relies par un peptide tres charge et vulnerable aux enzymes proteolytiques. Le domaine n-terminal conserve une structure propre au sein d'if3. Les experiences heteronucleaires 3d realisees sur un echantillon de la proteine complete marquee a l'isotope 15 de l'azote, permettent l'attribution de quelques residus. Malheureusement, l'information de couplage contenue dans les spectres tocsy est insuffisante pour mener a bien une attribution complete d'if3. Les premieres experiences heteronucleaires a triple resonance realisees sur un echantillon de proteine doublement marquee sont encourageantes. Elles devraient permettre de surmonter l'ensemble des difficultes d'attribution


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Informations

  • Détails : 166 P.
  • Annexes : 140

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