Etude de l'inhibition et de la purification de la proteine c activee humaine par l'aprotinine et comparaison avec un inhibiteur plasmatique apparente

par OLIVIER TABY

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de MARION STEINBUCH.

Soutenue en 1992

à Paris 11 .

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  • Résumé

    La coagulation du sang est la consequence d'une cascade de reactions enzymatiques aboutissant a la formation du caillot sanguin. Ce processus physiologique est regule par plusieurs systemes afin d'eviter sa generalisation. La proteine c est le precurseur d'une protease a serine qui est au cur d'un de ces systemes de controle. Cet enzyme inactive par proteolyse deux cofacteurs, les facteurs v et viii, participant a deux etapes cles de la cascade de la coagulation. Par ailleurs, il favorise indirectement la degradation du caillot de fibrine, en se complexant avec certains des inhibiteurs de la fibrinolyse. Apres avoir immunopurifie puis active la proteine c, nous avons decouvert que l'aprotinine (ou bpti) etait un inhibiteur competitif de la proteine c activee avec une constante d'inhibition k#i egale a 1,35 10#-#6 m. L'etude de cette inhibition a permis de demontrer que le site actif de l'enzyme ainsi que la lysine#1#5 de l'inhibiteur etaient impliques dans l'interaction. La purification de l'enzyme par chromatographie d'affinite sur l'inhibiteur insolubilise a pu etre realisee en partant d'une matiere premiere contenant encore de nombreuses proteines plasmatiques. Apres elimination d'un contaminant residuel par une autre etape chromatographique, on obtenait une preparation de proteine c activee de tres haute purete. L'inter-alpha-trypsine est une antiprotease presente dans le plasma possedant d'importantes analogies avec l'aprotinine. Cette proteine a ete isolee, puis un fragment comprenant les structures apparentees a ete obtenu par proteolyse limitee. L'inhibiteur et son derive se sont averes incapables d'inhiber la proteine c activee. Des etudes realisees in vitro sur du plasma humain, ont permis de demontrer que l'enzyme purifie presentait une activite biologique ainsi qu'une cinetique d'inhibition intactes. Les memes etudes effectuees avec des plasmas de differents animaux, ont montre que certains semblent de meilleurs modeles que d'autres pour realiser des etudes pharmacologiques de la proteine c activee humaine


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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2014-010940
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