Mutagénèse dirigée au site actif de la béta-lactamase TEM-1 : définition du rôle de différents résidus dans le mécanisme enzymatique

par Myriam Delaire

Thèse de doctorat en Microbiologie. Biotechnologie

Sous la direction de Jean-Michel Masson.

Soutenue en 1992

à Toulouse, INSA .


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  • Résumé

    Les beta-lactamases constituent la voie majeure de resistance aux beta-lactamines, antibiotiques tres utilises. Plusieurs residus de la beta-lactamase tem-1 d'escherichia coli, situes au niveau de la cavite catalytique de la proteine, ont ete etudies. Pour cela, chacun de ces residus a ete substitue par 15 autres acides amines grace a la methode de suppression informationnelle. Apres analyse de l'activite des variants ainsi obtenus, certains revertants ont ete construits par mutagenese dirigee, puis cinetiquement caracterises par microacidimetrie. A l'aide de ces donnees, mais aussi grace aux informations apportees par la structure tridimensionnelle de la proteine tem-1 resolue a 1,8 a, le role de chaque residu a alors pu etre determine. Ainsi, il apparait que l'arginine 244 intervient dans l'hydrolyse enzymatique en destabilisant le complexe enzyme-produit. La methionine 69 et la leucine 169 jouent quant a elles un role different: ces deux residus imposent des contraintes structurales au niveau du site actif qui permettent de maintenir une topologie optimale pour la fixation et l'hydrolyse des differents substrats de l'enzyme. Enfin, l'acide glutamique 166 est essentiel pour la catalyse enzymatique; ce residu intervient en tant que base generale dans l'etape de deacylation. La comparaison des structures tridimensionnelles de l'enzyme sauvage et du variant e166y, determinees a l'ibmc de strasbourg, a egalement apporte des indications sur l'adaptation conformationnelle de la beta-lactamase tem-1

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  • Détails : 141 f

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  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 1992/210/DEL
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