Clonage et expression du gène de la protéase de HIV-1 chez Escherichia coli. Etude de l'enzyme

par Viviane Valverde

Thèse de doctorat en Microbiologie. Biotechnologie

Sous la direction de Jean-Michel Masson.

Soutenue en 1992

à Toulouse, INSA .


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  • Résumé

    La protease de hiv-1 constitue une cible therapeutique interessante. Afin d'eviter les inconvenients d'une production virale, un gene synthetique a ete assemble puis exprime chez e. Coli. Deux versions du gene ont ete construites. L'une correspond a la forme mature de l'enzyme (pr100), l'autre code pour un precurseur (pr107). L'expression de la protease a ete optimisee grace a un outil genetique mis au point au laboratoire: la serie de plasmides para, inductibles a l'arabinose. D'apres une estimation realisee a l'aide de fusions avec lacz, 0,4mg a 4mg de protease soluble et directement active dans les conditions physiologiques peuvent etre obtenus par gramme de cellules. La purification de l'enzyme a donc ete entreprise. La sequence n-terminale supplementaire de la forme pr107 presente un effet amplificateur d'expression lorsqu'elle est placee en amont du gene de la protease mais aussi de lacz. Ce phenomene depend du promoteur et semble intervenir lors de la traduction. La protease recombinante est capable de s'automaturer in vivo des cotes n et c-terminaux a partir de ses formes fusionnees avec la beta-galactosidase. Des substitutions realisees sur les residus p4 et p5 de la jonction protease/beta-galactosidase, ainsi qu'une mutagenese systematique de l'acide amine en position p3 ont montre que la nature de ces residus n'etait pas determinante pour la proteolyse. Quelques inhibiteurs ont ete testes en conditions complexes et en presence du substrat naturel de la protease, la polyproteine gag. Des mutations ponctuelles dans l'enzyme ont revele l'importance des residus p(9), g(86) et n(87), particulierement conserves dans les proteases retrovirales

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  • Détails : 164 f

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 1992/186/VAL
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