Exploration in situ de la réplication de l'ADN dans le noyau de cellule eucaryote

par Catherine Humbert

Thèse de doctorat en Biol.

Sous la direction de Gérard Brugal.

Soutenue en 1992

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .


  • Résumé

    Ces travaux s'inscrivent dans le contexte de l'etude in situ des mecanismes de la replication de l'adn, plus precisement dans le cadre d'une analyse topographique de marqueurs specifiques (brdurd, pcna. . . ) pour la localisation intranucleaire des evenements intervenant au cours de la phase s d'une cellule eucaryote. Le double marquage adn/brdurd a ete optimise pour la cytometrie par analyse d'images. La revelation de l'adn en synthese par incorporation de brdurd et immunofluorescence revele une variete internucleaire de distribution des sites de replication. Ces facies de replication varient au cours de la phase s. L'utilisation d'une approche quantitative basee sur l'analyse spectrale des images (transformee de fourier) associes a un outil de classification automatique, nous a permis de valider de facon objective la sequence de ces facies. La sequence ainsi definie s'est averee correlee a la quantite d'adn mesuree dans les noyaux. Nous avons mis au point des parametres topographiques pour caracteriser la proportion, la localisation moyenne et son heterogeneite, de trois classes d'activite de replication. Les parametres calcules sont independants de la surface du noyau et de l'intensite de fluorescence. De plus, ils sont directement interpretables par reference a l'experience visuelle du cytologiste. Nous avons ainsi montre que chaque instant de la phase s du cycle cellulaire se caracterise par un facies de replication de l'adn. Les principales variations de distribution des sites de replication au cours de la phase s concernent la taille des sites (petits au debut et larges a la fin), et leur localisation (nucleoplasmique au debut et au milieu; perinucleaire et perinucleolaire ensuite; et principalement perinucleaire a la fin de la phase s). L'evolution de ce facies offre un fil conducteur utile pour ordonner dans le temps les evenements qui marquent la replication de l'adn. Enfin, pour replacer l'etude topographique dans le contexte proteique implique dans le processus de la replication de l'adn, nous avons associe le marquage brdurd au marquage d'une proteine du complexe de replication, le pcna. La visualisation simultanee de ces deux marqueurs, au moyen de la microscopie confocale a balayage laser, nous a permis de suivre cellule a cellule une enzyme du complexe de replication et le produit de la reaction de ce complexe proteique: l'adn nouvellement synthetise

  • Titre traduit

    In situ exploration of eukaryotic dna replication


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  • Détails : 204 f

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  • Cote : TS 92/GRE1/0011
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