Étude de l'interaction ADN-ADN topoisomérase II : étoposide sur des polynucléotides synthétiques

par Stéphane Crémier

Thèse de doctorat en Biophysique moléculaire

Sous la direction de Jean-Émile Morel.


  • Résumé

    Les ADN topoisomérases 2 sont des enzymes essentielles au contrôle de l'expression et de la structure du génome, régulant les contraintes mécaniques et topologiques de l’ADN. Leurs activités catalytiques nécessitent des coupures transitoires d'un ADN, au sein de complexes dits « clivables », permettant le passage d'un autre ADN au travers du premier. Ces complexes covalents peuvent être stabilisés par des agents antitumoraux, tel l'étoposide (VP-16). Les inhibiteurs de topoisomérase 2 étant d'emploi fréquent en clinique, la connaissance des mécanismes de la catalyse par l'enzyme et d'action des inhibiteurs est capitale. Nous avons étudié l'interaction d'une topoisomérase 2 de mammifère avec des polynucléotides synthétiques, certains contenant un seul site de coupure par l'enzyme, fortement stimulé par le VP-16. Nous avons mis en évidence trois types d'interactions : 1) une (électrostatique) non spécifique fortement coopérative, 2) une autre (partiellement hydrophobe) dépendant de la présence d'ions magnésium, probablement spécifique au site employé et coopérative, donnant des complexes non covalents résistants à un détergent, 3) une dernière spécifique à la séquence employée, dépendant de la présence d'ions magnésium, donnant des complexes covalents, assimilables aux complexes clivables. Ces complexes sont rares, indiquant que la coupure transitoire de l’ADN est un phénomène très instable. Le VP-16 augmente considérablement la fréquence des complexes clivables. Mais nous avons montré que les complexes covalents restent très minoritaires par rapport aux complexes spécifiques non covalents. En revanche, l'ensemble des complexes spécifiques représente la totalité des complexes ADN-topoisomérase 2 dans les conditions optimales d'interaction en présence de VP-16. Tirant parti de ces observations, nous avons mis au point un protocole de purification des topoisomérases 2 de mammifère, par affinité pour des polynucléotides en présence de VP-16. La méthode est rapide et efficace, produisant des topoisomérases 2 actives à leurs poids moléculaires théoriques. Nous avons commencé des études de la topoisomérase 2 et de ses interactions avec l’ADN par microscopie électronique, donnant des images surprenantes qui s'avèreront riches d'enseignements complémentaires dans un proche avenir.

  • Titre traduit

    DNA - DNA topoisomerase 2 - Etoposide interaction : a study with synthetic polynucleotides


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Informations

  • Détails : 1 vol. (137 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 362 réf.

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  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : TH 53851
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