Contribution au développement d'un vecteur d'expression de gènes chez les spiroplasmes, caractérisation fonctionnelle d'un promoteur et d'un terminateur de transcription, clonage et expression du gène de la chloramphenicol acetyltransferase (gène CAT) dans Spiroplasma Citri

par Corinne Arpin

Thèse de doctorat en Sc. de la vie

Sous la direction de JOSEPH-MARIE BOVE.

Soutenue en 1992

à Bordeaux 2 .


  • Résumé

    Les spiroplasmes sont des organismes procaryotes, a morphologie helicoidale et motiles dont certains sont pathogenes de plantes ou d'insectes. Depourvus de paroi, ils appartiennent a la classe des mollicutes. Ils derivent du phylum des bacteries gram+ a faible pourcentage de bases g+c par evolution regressive. Le developpement recent de la biologie moleculaire a permis de caracteriser le genome de ces organismes et d'identifier un certain nombre de genes. Cependant, peu d'informations sont disponibles concernant l'expression des genes et la fonction des proteines pour lesquelles ils codent. Dans ce contexte, nous avons etudie la transcription du virus spv4 de s. Melliferum pour caracteriser des signaux de regulation de la transcription fonctionnels chez les spiroplasmes. L'analyse des produits de transcription par northern blot, hydrolyse a la nuclease s1 et extension d'amorce a montre que ce signaux sont de type eubacterien. Ils sont fonctionnels chez e. Coli et chez s. Melliferum. Par ailleurs, les travaux du laboratoire ont montre que chez les spiroplasmes, le codon uga n'est pas un codon de terminaison de la traduction, mais code pour le tryptophane. De ce fait, les genes de spiroplasmes contenant un ou plusieurs codons tga (uga sur le mrna) ne peuvent etre etudies par clonage et expression dans une bacterie non suppressive. Pour contourner cette difficulte, le developpement d'un vecteur d'expression de genes chez les spiroplasmes a ete envisage. En utilisant la forme replicative du virus spv1 comme vecteur, le gene de la chloramphenicol acetyltransferase (gene cat) a ete clone et exprime dans s. Citri. Spv1 est un virus non lytique. Sa nucleocapside en batonnet contient un dna monocatenaire circulaire d'environ 8 kb dont la sequence nucleotidique a ete determinee. La technique d'electroporation a ete mise en uvre pour transfecter s. Citri avec la rf de spv1. L'efficacite de transfection atteint 10#6 transfectants par g de rf. Les spiroplasmes transfectes produisent des virions dont la presence est revelee par la formation de plages d'inhibition de croissance sur une pelouse de cellules indicatrices. L'insertion du gene cat, dans une region intergenique de la rf n'empeche pas la production de virions. Dans s. Citri, le gene cat est transcrit a partir d'un promoteur de spv1 et il est traduit en une proteine fonctionnelle. Pour demontrer que le systeme s. Citri/rf de spv1 est apte a exprimer des genes renfermant des codons tga, un tel codon a ete introduit dans le gene cat par mutation d'un codon tgg en tga. La mutagenese a ete realisee dans e. Coli et le gene cat, mute, a ete reintroduit dans s. Citri. Les resultats montrent que, dans e. Coli, il n'y a pas d'activite cat lorsque le gene est mute. Au contraire, dans s. Citri, l'activite cat n'est pas affectee par la mutation du codon tgg en tga


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  • Détails : [163] p

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  • Bibliothèque : Université de Bordeaux. Direction de la Documentation. Bibliothèque des Sciences du Vivant et de la Santé.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : CMTB 1992-169
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