Etude du site actif de la beta-lactamase tem-1 d'escherichia coli par mutagenese dirigee

par Françoise Lenfant

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Jean-Michel Masson.

Soutenue en 1991

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    Les beta-lactamases constituent un des principaux mecanismes de resistance aux antibiotiques de type beta-lactame. Une substitution systematique des acides amines de la beta-lactamase tem-1 d'escherichia coli a ete realisee afin d'etablir une veritable topologie du site actif. Une methode performante, de suppression informationnelle a ete developpee. Elle est basee sur l'introduction, par mutagenese dirigee, d'une mutation ambre a chaque position correspondante du gene suivie de l'insertion d'un nouveau acide amine, par l'expression de ce gene dans 15 souches d'e. Coli exprimant chacune un gene de trna suppresseur ambre. Ainsi, pres de 200 variants de la beta-lactamase tem-1 (soit 11 positions) ont ete construits et analyses pour leur niveau de resistance, in vivo, par antibiogrammes, et dans certains cas, pour leurs proprietes cinetiques, in vitro. Il a ete ainsi montre que certains residus participaient activement a la catalyse (residus 70, 73, 166, 130). D'autres servent a maintenir la structure tri-dimensionnelle (residus 68, 66). La lysine 234 intervient a la fois dans la reconnaissance initiale du substrat et dans la stabilisation a l'etat de transition. Par ailleurs, la mutation lys234->arg etend le spectre de substrats aux carboxypenicillines. Les substitutions de la glycine 238 par une serine, threonine ou alanine deplacent la specificite de substrats vers les cephalosporines et conferent a l'enzyme la capacite a hydrolyser les cephalosporines de troisieme generation. Mais, la combinaison de ces mutations avec la mutation e104k est indispensable pour conferer la resistance, in vivo. La proteine tem-1 a egalement ete purifiee. La determination de sa structure tridimensionnelle par cristallisation et diffraction aux rayons x a ete realisee a l'ibmc a strasbourg. La carte de densite electronique vient juste d'etre obtenue permettant un debut d'analyse detaillee de nos resultats en terme de relation structure-fonction


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  • Cote : 1991/161/LEN
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