Caracterisation structurale et genetique de la ferredoxine ii de rhodobacter capsulatus. Analyse fonctionnelle de son gene de structure fdxa. Purification et proprietes de le ferredoxine codee par fdxa dans escherichia coli

par CATHERINE DUPORT

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de PAULETTE VIGNAIS.

Soutenue en 1991

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    Le gene de structure de le ferredoxine ii (fdxa) a ete isole a partir d'une banque genomique de rhodobacter capsulatus en utilisant deux oligonucleotides synthetises sur la base de la sequence n-terminale de la proteine purifiee. La sequence nucleotidique d'un fragment hindiii-ecori de 1276 paires de bases (pb) contenant fdxa a ete determinee. L'etude des transcrits du gene fdxa a revele la presence d'un seul arnm de 400 bases environ. L'extremite 5 de ce transcrit a ete situee par des experiences de protection a la nuclease et d'extension d'amorce a 23 pb en amont du codon d'initiation atg. La region promotrice de fdxa a ete localisee a l'aide de vecteurs portant la fusion fdxa::lacz. La regulation de l'expression de fdxa a ete etudiee dans r. Capsulatus en mesurant l'activite -galactosidase d'une fusion fdxa::lacz. Le gene fdxa est exprime constitutivement. Des essais ont ete entrepris pour muter selectivement fdxa a l'aide d'interposons. Aucun mutant fdii# n'a pu etre isole. Une souche portant une deuxieme copie de fdxa sous le controle du promoteur inductible pnifb a ete construite. Il n'a pas ete non plus possible de selectionner une mutation dans la copie native de fdxa dans les conditions ou la seconde copie est induite. Le meme type de resultat a ete obtenu lorsqu'un plasmide portant le gene fdxa sous la dependance du promoteur fort pnifh est introduit dans r. Capsulatus. Le gene fdxa est vraisemblablement essentiel pour r. Capsulatus. Le produit du gene fdxa a ete isole et purifie chez e. Coli. La sequence n-terminale et les proprietes spectroscopiques de la ferredoxine recombinante sont comparables a celles de la ferredoxine ii native


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