Etude du gene glna de methanococcus voltae et construction d'un vecteur d'integration permettant d'exprimer un marqueur de resistance eubacterien chez cette archaebacterie methanogene

par ODILE POSSOT

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Jean-Paul Aubert.

Soutenue en 1990

à Paris 7 .

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  • Résumé

    Un fragment d'adn de mc. Voltae portant de l'homologie au gene glna d'anabaena a ete sequence. Une phase ouverte de lecture de 1. 338 pb, a ete identifiee a glna sur la base de sa similitude avec les autres genes glna et de sa capacite de complementer un mutant d'e. Coli, elle code pour un polypeptide de 446 aminoacides et de 50. 142 daltons. Le gene glna de mc. Voltae a le plus de similitude avec les genes de bacillus subtilis et de clostridium acetobutylicum. Il est transcrit en un messager monocistronique; les regions encadrant l'orf glna n'ont aucune homologie avec d'autres genes ou sequences. Des mesures de l'activite glutamine synthetase indiquent que l'enzyme est partiellement reprime a de hautes concentrations en nh4#+. L'etude de la sensibilite de mc. Voltae a divers composes a permis de mettre en evidence six antibiotiques capables d'inhiber sa croissance. La caracterisation, in vitro, de leurs cibles biochimiques chez mc. Voltae a montre qu'elles sont identiques a celles connues chez les eubacteries: l'acide pseudomonique inhibe l'ile-arnt synthetase, la puromycine et l'acide fusidique inhibent la synthese proteique. Les effets de la coumermycine, de la novobiocine et de la ciprofloxacine, etudies notamment chez les methanogenes suggerent que les arachaebacteries possedent une adn gyrase de type eubacterien. Des vecteurs d'integration bases sur le vecteur puc18 d'e. Coli ont ete construits en introduisant, en particulier, dans le gene hisa de mc. Voltae, le gene de resistance a la puromycine (pac de streptomyces alboniger) ou le gene de resistance a l'acide fusidique (cat du transposon tn9) flanques de signaux forts de transcription de mc. Voltae. Apres transformation de cette souche, des bacteries ayant acquis la resistance a la puromycine par integration du vecteur dans le chromosome, ont pu etre selectionnees. Le gene pac d'origine bacterienne s'exprime de facon stable chez mc. Voltae


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