Bioconversion de D, L-hydantoines 5-monosubstituées : contribution à l'étude biochimique de l'hydantoinase et de la N-carbamyl aminoacide hydrolase d'Agrobacterium sp. IP-I 671

par Serge Runser

Thèse de doctorat en Génie Enzymatique, Microbiologie et Bioconversion

Sous la direction de Guy Ourisson.


  • Résumé

    Cette thèse présente la caractérisation biochimique, par des études sur des cellules entières en survie et sur des extraits protéiques, d'une hydantoïnase et d'une N-carbamyl aminoacide hydrolase responsables chez Agrobacterium sp. IP-I 671 de la bioconversion des D, L -hydantoïnes 5-monosubstituées en leurs D-aminoacides correspondants. Une nature strictement intracellulaire, une stricte stéréospecificité, une large spécificité de substrats et des optima réactionnels très différents sont démontrés pour les deux hydrolases. L'induction de la biosynthèse cellulaire de l'hydantoùîse par le thio-2 uracile, et l'inhibition de la N-carbamyl aminoacide hydrolase par les ions ammoniums coproduits dans la réaction de bioconversion sont mis en évidence; la participation à ce système enzymatique d'une hydantoïne-racémase est aussi prouvée. La stabilité exceptionnelle de l'hydantoïnase vis-à-vis de la température ou du pH, son activation par les ions nickel ou colbalt, et son inactivation réversible par les réactifs des groupes sulfhydriles est démontrée. L'affinité de l'hydrolase pour différentes D, L-hydantoïnes 5-monosubstituées est déterminée par la mesure des Km respectifs; le caractère d'inhibiteur compétitif d'une hydantoïne 5,5- disubstituée et d'un dérivé thiolé d'hydantoïne est aussi prouvé. La purification à homogénéité apparente de l'hydantoïnase a permis de démontrer sa structure oligométrique quaternaire, soit un poids moléculaire de 250 Kda pour le tétramère, et de 60 Kda pour le monomère, ainsi qu'un point isoélectrique proche de la neutralité pour cette protéine.

  • Titre traduit

    Bioconversion of D, L-5-monosubstituted hydantoins : contribution to the biochemical study of the hydantoinase and N-carbamyl amino acid hydrolase of Agrobacterium sp. IP-I 671


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    The hydantoin and N-carbamyl amino acid hydrolyzing enzymes of a newly isolated Agrobacterium sp. Were studied at the level of the whole-cell bioconversion reaction and the level of the purified protein. The strictly D-stereospecific hydantoinase and D-stereospecific N-carbamyl amino acid hydrolase were shown to be responsible for the asymmetric conversion of D,L-5-p-hydroxyphenylhydantoin into D-p-hydroxyphenylglycine. Both enzymes exhibit a large substrate specificity, but have very different kinetic features: pH-optimum and temperature optimum were found to be respectively pH 9 - 10 and 55 - 60 °C for the hydantoinase, and pH 6. 75 and 45 °C for the j'j-carbamyl amino acid hydrolase. The biosynthesis of the former hydrolase could be slightly induced by addition of different hydantoins, pyrimidins or cyclic amides to the cultivation media; among these molecules 2-thiouracil gave the best induction effect. The N-carbamyl amino acid hydrolase was shown to be strongly inhibited by the ammonium ions co¬produced with the D-amino acid. The involvement of an hydantoin-racemase in this enzyme system could also be demonstrated. The hydantoinase could be purified to apparent homogeneity by methods including salting-out, heat-treatment and different chromatographic and electrophoretic steps. The purified protein appears to have a tetrameric structure as the apparent molecular weight is ca. 250 Kd when measured by gel-filtration chromatography, and ca. 60 Kd when determined by SDS-PAGE. Isoelectric point was found to be ca. PH 6. 7. Kinetic studies on the partially purified hydantoinase have proven its high temperature and broad pH stability; its activation by nickel ions; and its inactivation by several thio-reagents, which can be alleviated by reducing agents. Km measurements led to the observation of an equal affinity of the enzyme toward several 5-monosubstituted hydantoins. 5,5-Dimethylhydantoin and D,L-5-p-hydroxyphenyl-2-thio-hydantoin, which are not hydrolyzed by this hydantoinase, behave both as competitive inhibitors.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (173 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 101 réf.

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