Contribution à l'étude des mouvements conformationnels de la sous-unité β2 de la tryptophane synthase de E. Coli : utilisation des propriétés de fluorescence et de réactivité immunochimique

par Alain-François Chaffotte

Thèse de doctorat en Sciences biologiques

Sous la direction de Directeur de thèse inconnu.

Soutenue en 1986

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté des sciences d'Orsay (Essonne) (autre partenaire) .

mots clés

• Mouvements conformationnels
• Anticorps polyclonaux
• Tryptophane synthase (sous unité β2)
• Tryptophane
• Fluorescence
• Anticorps monoclonaux
• Escherichia coli

Résumé

Cette thèse présente l'étude de certains aspects de la dynamique conformationnelle de la sous-unité β₂ de la tryptophane synthase (L­ serine hydro-lyase (adding indole) EC 4. 2. 1. 20) et en particulier, les modulations induites par deux ligands : le pyridoxal-5'-phosphate et la sous-unité α, tous deux nécessaires pour l'activité de l'enzyme. Deux types d'approches ont été mises à profit : - La première est fondée sur les propriétés de fluorescence intrinsèque de la protéine β₂ et son atténuation par l'acrylamide. Cette méthode a permis la mise en évidence d'un changement de conformation induit par le pyridoxal-P dans le domaine N-terminal de la chaine β. - La seconde approche met à profit les propriétés immunogéniques et antigéniques de la protéine. Des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine dénaturée ont été utilisés pour estimer l'aptitude de la protéine native à se dénaturer spontanément et réversiblement et mettre ainsi en évidence les effets stabilisants exercés par le pyridoxal-P et la sous-unité α. Un anticorps monoclonal obtenu par immunisation avec la protéine native et reconnaissant sélectivement un état non natif de celle-ci a été utilisé pour caractériser quantitativement un mode dynamique particulier de β₂. L'étude cinétique et à l'équilibre de l'interaction entre cet anticorps et β₂ a montré que ce mode dynamique correspond à la dissociation de l'enzyme en monomères β et de déterminer la constante d'équilibre de cette dissociation. Cette constante a été trouvée égale à 5 x 10-8 M.

Titre traduit

Studies on conformational changes of the β2-subunit of Escherichia coli tryptophan synthase : use of its fluorescence properties and immunochemical reactivity

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