Purification et immobilisation de la chymosine

par Leïla Amourache

Thèse de doctorat en Microbiologie, génie enzymatique et bioconversion

Sous la direction de Mookambeswaran A. Vijayalakshmi.


  • Résumé

    La chromatographie d'affinité utilisant un ligand biospécifique (pepstatine couplée à l'agarose) pour la purification de la chymosine permet l'obtention d'un rendement en activité de 60 % et un facteur de purification de 6, à partir d'un extrait brut. Cependant, le ligand acide aminé histidine couplé au Sepharose 4B et à la silice, a donné de meilleurs résultats, on obtient respectivement après purification de la chymosine, à partir d'un extrait brut : des rendements en activité de 330 %, 55 % ; et des facteurs de purification de 26 et 9. Le L-histidyl-silice présente des résultats peu satisfaisants par rapport au support L-histidyl- Sepharose 4B. Une optimisation des conditions d'utilisation du gel histidyl-silice serait souhaitable afin d'utiliser ce dernier en HPLC. La purification d'enzyme d'origine microbienne sur gel de L- histidyl-Sepharose permettrait de connaitre l'efficacité de ce gel pour ce type d'enzyme. Notre étude d'immobilisation de la chymosine sur un support nylon nous amène à considérer, que le choix du nylon offre l'avantage d'une mise en œuvre aisément applicable en industrie alimentaire, toutefois l'activité résiduelle reste encore faible notamment lors de l'emploi du glutaraldéhyde. L'activité résiduelle est considérablement améliorée par la BSA et le NaC1 ajoutés au milieu en fin de réaction et aussi lors de l'utilisation de l'agent covalent carbodiimide. Une application industrielle de la chymosine immobilisée nécessiterait un travail complémentaire : 1 - Neutraliser les groupements du support amine et carboxyl restant disponibles après immobilisation par la liaison covalente. Ceux-ci sont la cause d'une adsorption du substrat non désiré. 2- Approfondir la réalité des liaisons qui s'établissent entre l'enzyme et le support. 3 - Obtenir une enzyme très stable.

  • Titre traduit

    Purification and immobilized chymosine


  • Résumé

    Affinity chromatography using pepstatine agarose for crude chymosine purification a 60 % yield with a 6 fold increase in specific activity. On the other hand, L-histidine coupled Sepharose 4B and silica gave better results with 33 % and 55 % yields and 26 and 9 fold purifications, respectively. The silica support, as seen the above results, gives less satisfying results when compound with hystidyl-sepharose. It would be necessary to optimise the end conditions before applying this technique for chymosine purification by HPLAC. Also, studies using chymosine of microbial origin would enable as to evaluate the efficiency of the gel for this sat of enzyme. After studies on the immobilization of chymosine we consider that the choice of nylon as an immobilization support would be advantageous for the food industry, the usidial activity, however remain low especially when glutaraldehyde is used. The use of BSA and NaC1 in the medium during storage increases the residual activity considerably. The use of carbodiimide equally gives better results. The industrial application of immobilized chymosine would require the following complementary studies : the neutralizations of free amine and carboxyl groups on the nylon surface after the immobilization ; to pursue an in-dyth study into the sort of bond existing between enzyme and the nylon support ; to procure a highly stable enzyme.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (100 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 65 réf.

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  • Cote : 1986 AMO I217

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  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : 1986COMPI217
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