Enzymes immobilises d'Escherichia coli : dénaturation et renaturation de la β -galactosidase immobilisée, électrode a enzyme utilisant la chaine respiratoire immobilisée pour la mesure du L-malate

par Kebir Boucherit

Thèse de doctorat en Biochimie

Sous la direction de Claude Burstein.

Soutenue en 1985

à Paris 7 .


  • Résumé

    La première partie de notre travail porte sur la réactivation, par traitement à l'urée, de la 13-galactosidase de l'extrait brut d' Escherichia coli inactivée par la température avant et après immobilisation. L'inactivation par la température entraine une perte d'activité de la β-galactosidase soluble et après passage dans l'urée 8M et dialyse de 18 heures avec du tampon, l'activité est régénérée à 75% par rapport à l'ex trait brut initial. La β -galactosidase immobilisée en présence de gélatine par le glutaraldéhyde (0,25%) et inactivée par la température peut être réactivée dans une colonne après traitement à l'urée et lavage du polymère avec du tampon. La cinétique de réactivation de la β-galactosidase immobilisée est complète au bout de 100 minutes environ. Le rendement de l'immobilisation est constant à 0,25 - 0,50 et 0,75% de glutaraldéhyde par contre le pourcentage de réactivation diminue quand la concentration de l'agent pontant augmente. La deuxième partie consiste à mettre au point une électrode enzymatique pour le dosage du L-malate. La flavoprotéine spécifique de l'oxydation du L-malate, élément de la chaîne respiratoire d’ Escherichia coli est induite par la culture des bactéries en milieu minimum en présence de D-L-malate 1% comme seule source de carbone. Les bactéries entières D-L-malate sont immobilisées sur film par inc lusion dans de la gélatine et coréticulation avec du glutaraldéhyde. Les conditions optimales d'immobilisation sont établies, elles concernent la quantité de matériel biologique et les concentrations de gélatine et de glutaraldéhyde. Après immobilisation, la chaîne respiratoire est active et est capable d'oxyder le L-malate en absence de cofacteurs (NAD+, NADP. . . ). Le film enzymatique est mis en contact étroit avec la partie sensible d'une électrode à oxygène (type électrode de Clark). L'addition du L-malate provoque une diminution de la concentration d'oxygène dans le film et donne un signal qui est enregistré. Après avoir analysé le signal émis par l'électrode à L-malate, les constantes cinétiques (VM, K50) ont été déterminées, une courbe de pH a été effectuée, le pH optimum est situé entre 6 et 7, à pH 4 l'activité du film enzymatique n'est réduite que de 50% et permet l'utilisation de l'électrode à L-malate directement dans les milieux biologiques (exemple le vin). L'oxaloacétate (produit de la réaction) et le D-malate inhibent de façon réversible la respiration du L-malate. Le malate peut être dosé dans la gamme de concentration de 0,1mM à 30mM.

  • Titre traduit

    Escherichia coli immobilized enzymes. Denaturation and renaturation of immobilized beta -galactosidase. Enzyme electrode using the immobilized respiratory chain for l-malate determination


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Informations

  • Détails : 1 vol. (101 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 86-94

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  • Cote : TS (1985) 105
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